Name: isolation and culture of human fungiform taste papillae cells
Uploaded: 2012-05-17T12:00:00
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Damos las gracias a Aimee Myers y Quayson Esi por sus habilidades técnicas y de ayuda. Este trabajo fue apoyado en parte por la NSF 0216310 y Givaudan Inc subvención (NER).

1. La obtención de papilas fungiformes Humanos Sabor <ol><li> Retire cuatro hasta ocho papilas fungiformes humana sabor de la superficie dorsal de la porción anterior de la lengua con microtijeras curvas de primavera. </li><li> Colocar inmediatamente en una solución de aislamiento (26 mM NaHCO 3, 2,5 mM de NaH 2 PO 4, 20 mM de glucosa, 65 mM de NaCl, 20 mM de KCl, y EDTA 1 mM disuelto en agua libre de nucleasa y se esteriliza por filtración). </li></ol> 2. Gus...

<ol>
	<li>Mbiene, J. P., Maccallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia.">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> J. Comp. Neurol. 377, 324-340 (1997).</li><li>Miyamoto, T., Fujiyama, R., Okada, Y., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+difference+in+amiloride-sensitivity+of+salt-induced+responses+in+mouse+non-dissociated+taste+cells.">Strain difference in amiloride-sensitivity of salt-induced responses in mouse non-dissociated taste cells.</a> Neurosci. Lett. 277, 13-16 (1999).</li><li>Caicedo, A., Jafri, M. S., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells.">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> J. Neurosci. 20, 7978-7985 (2000).</li><li>Qin, Y. M., Shi, J. Q., Zhang, G. H., Deng, S. P., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+method+to+obtain+cells+of+taste+buds+from+fungiform+papillae+of+mice.">A reliable method to obtain cells of taste buds from fungiform papillae of mice.</a> Acta Histochem. 112, 107-112 (2010).</li><li>Spielman, A. I., Mody, I., Brand, J. G., Whitney, G., MacDonald, J. F., Salter, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+isolating+and+patch-clamping+single+mammalian+taste+receptor+cells.">A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor cells.</a> Brain Res. 503, 326-329 (1989).</li><li>Kishi, M., Emori, Y., Tsukamoto, Y., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+rat+taste+bud+cells+that+retain+molecular+markers+for+taste+buds+and+permit+functional+expression+of+foreign+genes.">Primary culture of rat taste bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression of foreign genes.</a> Neuroscience. 106, 217-225 (2001).</li><li>Ruiz, C. J., Stone, L. M., McPheeters, M., Ogura, T., Bottger, B., Lasher, R. S., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+rat+taste+buds+in+primary+culture.">Maintenance of rat taste buds in primary culture.</a> Chem. Senses. 26, 861-873 (2001).</li><li>Stone, L. M., Tan, S. S., Tam, P. P., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+lineage+relationships+in+taste+buds.">Analysis of cell lineage relationships in taste buds.</a> J. Neurosci. 22, 4522-4529 (2002).</li><li>Ozdener, H., Yee, K. K., Cao, J., Brand, J. G., Teeter, J. H., Rawson, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+long-term+maintenance+of+rat+taste+cells+in+culture.">Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture.</a> Chem. Senses. 31, 279-290 (2006).</li><li>Ozdener, M. H., Brand, J. G., Spielman, A. I., Lischka, F. W., Teeter, J. H., Breslin, P. A., Rawson, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Human+Fungiform+Papillae+Cells+in+Culture.">Characterization of Human Fungiform Papillae Cells in Culture.</a> Chem. Senses. 36, 601-612 (2011).</li><li>Gomez, G., Rawson, N. E., Hahn, C. G., Michaels, R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+odorant+elicited+calcium+changes+in+cultured+human+olfactory+neurons.">Characteristics of odorant elicited calcium changes in cultured human olfactory neurons.</a> J. Neurosci. Res. 62, 737-749 (2000).</li><li>Wolozin, B., Sunderland, T., Zheng, B. B., Resau, J., Dufy, B., Barker, J., Swerdlow, R., Coon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+neuronal+cells+from+adult+human+olfactory+epithelium.">Continuous culture of neuronal cells from adult human olfactory epithelium.</a> J. Mol. Neurosci. 3, 137-146 (1992).</li><li>Wick, N., Saharinen, P., Saharinen, J., Gurnhofer, E., Steiner, C. W., Raab, I., Stokic, D., Giovanoli, P., Buchsbaum, S., Burchard, A., Thurner, S., Alitalo, K., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomal+comparison+of+human+dermal+lymphatic+endothelial+cells+ex+vivo+and+in+vitro.">Transcriptomal comparison of human dermal lymphatic endothelial cells ex vivo and in vitro.</a> Physiol. Genomics. 17, 179-192 (2007).</li><li>Fu, L., Zhu, L., Huang, Y., Lee, T. D., Forman, S. J., Shih, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+stem+cells+from+mesenchymal+stemcells:+evidence+for+a+bipotential+stem+cell+population.">Derivation of neural stem cells from mesenchymal stemcells: evidence for a bipotential stem cell population.</a> Stem Cells Dev. 17, 1109-1121 (2008).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+isolation+and+culture:+intact+vascular+endothelium+and+BKCa.">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297, H1-H7 (2009).</li></ol>

Hemos mantenido las células obtenidas a partir de las papilas fungiformes humana gusto por más de 8 pasajes, que abarca un período de 12 meses. Estas culturas generar nuevas células, muchos de los que maduran in vitro a la etapa en la que expresan marcadores de varios tipos de células maduras sabor brote, además de importantes propiedades moleculares y fisiológicas de las células receptoras del gusto. La presencia de gusducina y el PLC-β2 inmunoreactividad en los subconjuntos de células en cultivo es ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> MCDB 123 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Iscove medio DMEM </td><td> Mediatech </td></tr><tr><td> Elastasa </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Pronasa E </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Elastasa </td><td> Worthington </td></tr><tr><td> Soja inhibidor de tripsina </td><td> Worthington </td></tr><tr><td> La colagenasa tipo 1 </td><td> Worthington </td></tr><tr><td> Cola de rata colágeno tipo 1 </td><td> BD Ciencias </td></tr><tr><td> Fura-2 PM </td><td> Molecular Probes </td></tr><tr><td> Superíndice primer capítulo de síntesis del sistema de RT-PCR </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Leica TCS SP2 microscopio confocal espectral </td><td> Leica Microsystems, Inc. </td&gt; </tr><tr><td> Descubrimiento-1 imagen de la estación y el software Metamorph </td><td> Molecular Devices </td></tr><tr><td> Pequeñas punta fina fórceps y tijeras adicionales de primavera </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of human fungiform taste papillae cells

Las células del gusto son altamente especializado, con características histológicas, moleculares y fisiológicos que permiten la detección de una amplia gama de estímulos simples y moléculas químicas complejas contenidas en los alimentos. En papilas humana, individual fungiformes contener de cero a un máximo de 20 papilas gustativas. No existe un protocolo establecido para el cultivo de células gustativas humanos, aunque la capacidad de mantener las células del gusto papilas en la cultura de los ciclos múltiples de la célula sería de considerable utilidad para la caracterización de las propiedades moleculares, regeneradoras y funcionales de estas células sensoriales únicas. Los primeros estudios de las células gustativas se han realizado utilizando recién células aisladas en cultivo primario, cultivos de explantes de los roedores, o semi-intactas las papilas gustativas en cortes de tejido 1,2,3,4. Aunque cada una de estas preparaciones tiene ventajas, el desarrollo de cultivos a largo plazo se han proporcionado beneficios significativos, en particular para los estudios de células sabor proliferación y diferenciaciónrentiation. Varios grupos, incluyendo el nuestro, se han interesado en el desarrollo y establecimiento de modelos de cultivo de células gustativas. La mayoría de los intentos de las células gustativas de la cultura han informado de viabilidad limitada, con las células por lo general no duran más allá de 3-5 días 5,6,7,8. Recientemente hemos informado de un método exitoso para el cultivo prolongado de las células gustativas de roedores 9. Estamos aquí informe por primera vez el establecimiento de un sistema de cultivo in vitro de células aisladas de humanos fungiformes papilas gustativas. Las células de las papilas fungiformes humana obtenidas por biopsia se mantuvieron con éxito en la cultura durante más de ocho pasos (12 meses) sin pérdida de viabilidad. Las células muestran muchas características moleculares y fisiológicos característicos de las células gustativas maduros. Gustducin y la fosfolipasa C β2, (PLC-β2) mRNA se detectó en muchas células por reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa y confirmados por secuenciación. Análisis de inmunohistoquímica demostraron la presencia de ráfagasducin y el PLC β2-expresión en las células gustativas cultivadas. Cultivadas células fungiformes humanos también mostraron aumentos en el calcio intracelular en respuesta a concentraciones apropiadas de los estímulos de sabor que indican que varios receptores del sabor y al menos algunas de las vías de señalización estaban presentes. Estos resultados indican que suficientes células del gusto de los humanos adultos pueden ser generados y mantenidos durante al menos ocho pasajes. Muchas de las células conservan las características fisiológicas y bioquímicas de las células aisladas de forma aguda el epitelio gusto de adultos para apoyar su uso como un sistema modelo de gusto. Este sistema permitirá realizar más estudios sobre los procesos implicados en la proliferación, diferenciación y función de mamíferos, células receptoras del gusto de una preparación in vitro. Papilas fungiformes el gusto humano utiliza para el establecimiento de la cultura humana de células fungiformes fueron donados para la investigación tras el consentimiento informado adecuado bajo protocolos de investigación que fueron revisadosy aprobado por el comité del IRB. El protocolo (# 0934) fue aprobado por los Asociados Schulman Junta de Revisión Institucional Inc., Cincinnati, OH. Protocolo escrito a continuación se basa en los parámetros publicados reportados por Ozdener et al. 2011 10.

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Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

El objetivo fue desarrollar un protocolo reproducible para aislar y mantener a largo plazo de cultivos de células humanas las papilas fungiformes gusto. Las células de las papilas fungiformes humana obtenidas por biopsia se mantuvieron con éxito en la cultura durante más de ocho pasos (12 meses) sin pérdida de viabilidad.

Aislamiento y cultivo de células humanas las papilas fungiformes gusto

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Investigación

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