Name: isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea
Uploaded: 2012-09-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea at JoVE.com

Vi ønsker å erkjenne den brede Stem Cell Research Center FACS og spesielt takke Jessica Scholes og Felicia Codrea for deres hjelp med celle sortering. Arbeidet ble finansiert av CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / KOLS Foundation ATS-06-065, The Concern Foundation, The UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / Lung Cancer SPORE, University of California Cancer Forskning Coordinating Committee og Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).

Oversikt over Steps 1. Disseksjon av trachea 2. Rengjøring luftrøret og kutte det 3. Enzym fordøyelse og prosessering i enkel cellesuspensjon 4. Flekker for FACS og sortering 5. Behandler sortert celler for in vivo og in vitro modeller 1. Disseksjon av Trachea <ol><li> Avlive musen med en intraperitoneal injeksjon av 0,1 mg/0.2 c...

<ol>
	<li>Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+functions+of+the+airway+epithelium.">Innate immune functions of the airway epithelium.</a> Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).</li><li>Finkbeiner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathology+of+tracheobronchial+glands.">Physiology and pathology of tracheobronchial glands.</a> Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).</li><li>Hegab, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Stem/Progenitor+Cell+Population+from+Murine+Tracheal+Submucosal+Gland+Ducts+with+Multipotent+Regenerative+Potential.">A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+features+of+airway+surface+epithelial+cells+and+glands.">Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).</li><li>Rock, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).</li><li>Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+identifies+a+subpopulation+of+murine+and+human+prostate+basal+cells+with+stem+cell+characteristics.">Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+an+epithelial+stem/progenitor+cell+hierarchy+in+the+adult+mouse+lung.">Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).</li><li>Inayama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+growth+and+differentiation+of+clones+of+tracheal+basal+cells.">In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells.</a> Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).</li><li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Bronchial+Epithelial+Cells+Differentiate+to+3D+Glandular+Acini+on+Basement+Membrane+Matrix.">Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).</li><li>Ooi, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+putative+tumor-initiating+progenitor+cell+population+predicts+poor+prognosis+in+smokers+with+non-small+cell+lung+cancer.">Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer.</a> Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).</li></ol>

Denne teknikken til å isolere duct og basal celler fra luftveiene er viktig for å forbedre vår forståelse av luftveiene reparasjon og regenerering og luftveissykdommer. Teknikkene som beskrives her inkluderer noen viktige skritt. Den første er den optimaliserte enzymatisk fordøyelse perioden. Den andre er etableringen av en enkelt celle suspensjon gjennom seriell passaging med stadig høyere gage nåler for å hindre celle shearing men å bryte opp celle klumper. Den tredje er FACS analyse, og gating av celler med...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Komplett medium 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td></tr><tr><td> HEPES (15 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> Natriumbikarbonat (3.6mm eller 0,03%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-glutamin (4 mm) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-Cl </td></tr><tr><td> Penicillin (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Streptomycin (100 ug / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Amfotericin B (0,25 ug / ml) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> Isulin (10 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrin (5 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> Koleratoksin (0,1 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> Epidermal vekstfaktor (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> Bovine hypofyseekstrakt (30 mikrogram / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum (5%) </td><td> Fisher </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> Retinsyre (0,05 uM) </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> Growth Factor Redusert Matrigel </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Fullfør mediekomponenter. <table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td&gt; <td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 10165921001 </td><td> Brukes på 0,15%: -O / n ved 4 ° C fordøyelsen å isolere totalt tracheal celler (for ALI kultur) -4 Hr fordøyelsen 4 ° C for å isolere SMG </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> Brukes på 16 Enheter: 30 min ved RT </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> Brukes på 0,5 mg / ml: 20-30 min ved RT </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Enzymer brukt for enzymatisk fordøyelse av luftrøret.

isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea

Den store luftveiene er direkte i kontakt med miljøet, og derfor utsatt for skader fra giftstoffer og smittestoffer som vi pusten i en. Den store luftveiene krever derfor en effektiv reparasjon mekanisme for å beskytte kroppen vår. Denne reparasjonsprosessen oppstår fra stamceller i luftveiene og isolere disse stamcellene fra luftveiene er viktig for å forstå mekanismene for reparasjon og regenerering. Det er også viktig for å forstå unormal reparasjon som kan føre til luftveissykdommer 2. Målet med denne metoden er å isolere en roman stamcelle befolkningen fra musen tracheal submukøst kjertel kanaler og å plassere disse cellene i in vitro-og in vivo modellsystemer for å identifisere mekanismene for reparasjon og regenerering av submukøst kjertler 3. Denne produksjonen viser metoder som kan brukes til å isolere og analysen kanalsystem og basal stamceller fra store luftveiene 3. Dette vil tillate osså studere sykdommer i luftveiene, slik som cystisk fibrose, astma og kronisk obstruktiv lungesykdom. Foreløpig er det ingen metoder for isolering av submukøst kjertel duct celler og det er ingen in vivo modeller for å studere regenerering av submukøst kjertler.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea at JoVE.com

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Her viser vi vår protokoll for isolering av basal og submucosal kjertel duct celler fra mus tracheas. Vi også demonstrere metoden av å injisere stamceller i dorsal musen fett puten å skape en<em&gt; In vivo</em&gt; Modell av submucosal kjertel gjenfødelse.

Isolering av basal celler og submukøst Gland kanalsystem celler fra mus Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon Mus Utledet fra Utførte pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolasjon og kultur av Dental Epiteliale stamceller fra voksne musen Fortann

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...