Name: isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea
Uploaded: 2012-09-14T12:00:00
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Gostaríamos de reconhecer as grandes Stem Cell FACS Centro de Pesquisa e agradecer especialmente Jessica Scholes e Felicia Codrea por sua ajuda com a classificação celular. O trabalho foi financiado pelo CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, da American Thoracic Society / Fundação DPOC ATS-06-065, A Fundação preocupação, a UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology SPORE Cancer Program / Pulmão, da Universidade da Califórnia do Câncer Pesquisa Comissão de Coordenação e Gwynne Hazen cereja Memorial Laboratories (BG).

Esboço de Passos 1. Dissecção da traquéia 2. Limpeza traquéia e cortá-lo 3. Digestão enzimática e transformação em suspensão de célula única 4. A coloração por FACS e triagem 5. Processamento de células classificadas para in vivo e in vitro, em modelos 1. Dissecção da traquéia <ol><li> Euthanize o rato com uma inj...

<ol>
	<li>Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+functions+of+the+airway+epithelium.">Innate immune functions of the airway epithelium.</a> Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).</li><li>Finkbeiner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathology+of+tracheobronchial+glands.">Physiology and pathology of tracheobronchial glands.</a> Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).</li><li>Hegab, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Stem/Progenitor+Cell+Population+from+Murine+Tracheal+Submucosal+Gland+Ducts+with+Multipotent+Regenerative+Potential.">A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+features+of+airway+surface+epithelial+cells+and+glands.">Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).</li><li>Rock, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).</li><li>Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+identifies+a+subpopulation+of+murine+and+human+prostate+basal+cells+with+stem+cell+characteristics.">Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+an+epithelial+stem/progenitor+cell+hierarchy+in+the+adult+mouse+lung.">Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).</li><li>Inayama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+growth+and+differentiation+of+clones+of+tracheal+basal+cells.">In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells.</a> Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).</li><li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Bronchial+Epithelial+Cells+Differentiate+to+3D+Glandular+Acini+on+Basement+Membrane+Matrix.">Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).</li><li>Ooi, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+putative+tumor-initiating+progenitor+cell+population+predicts+poor+prognosis+in+smokers+with+non-small+cell+lung+cancer.">Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer.</a> Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).</li></ol>

Esta técnica para isolar as células do ducto e basal das vias aéreas é importante para melhorar a compreensão de reparação e regeneração das vias aéreas e de doenças das vias respiratórias. As técnicas descritas aqui incluem alguns passos críticos. O primeiro é o período de digestão enzimática optimizado. A segunda é a criação de uma suspensão de células individuais através de passagens em série com agulhas calibre progressivamente mais elevadas para impedir ruptura da célula, mas a romper-se g...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Conclua médio 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090 CV- </td></tr><tr><td> Hepes (15 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio (3,6 mM ou 0,03%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-glutamina (4 mM) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 Cl- </td></tr><tr><td> Penicilina (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001 CI- </td></tr><tr><td> Estreptomicina (100 ug / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001 CI- </td></tr><tr><td> Anfotericina B (0,25 ug / ml) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> EmSulin (10 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrina (5 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> Toxina da cólera (0,1 ng / ml) </td><td> Sigma </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> Factor de Crescimento Epidérmico (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> Extrato de Pituitária Bovina (30 ug / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> O soro de bovino fetal (5%) </td><td> Pescador </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> Ácido retinóico (0,05 uM) </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> Fator de Crescimento reduzido Matrigel </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Conclua componentes de mídia. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td&gt; <td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 10165921001 </td><td> Usado em 0,15%: -O / n a 4 ° C para isolar a digestão total de células para a cultura de traqueia (ALI) Digestão hr -4 4 ° C para isolar SMG </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> Usado menos 16 Unidades: 30 min à TA </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> Utilizada a 0,5 mg / ml: 20-30 min à temperatura ambiente </td></tr></tbody></table> Enzimas Tabela 2. Usado para a digestão enzimática da traqueia.

isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea

Grandes vias aéreas estão diretamente em contato com o meio ambiente e, portanto, suscetível a lesões de toxinas e agentes infecciosos que respiramos em 1. Grandes vias aéreas, portanto, exigem um mecanismo de reparo eficiente para proteger os nossos corpos. Este processo de reparo ocorre a partir de células-tronco nas vias aéreas e isolar essas células-tronco das vias aéreas é importante para compreender os mecanismos de reparo e regeneração. Também é importante para a compreensão de reparação anormal que pode conduzir a doenças das vias aéreas 2. O objectivo deste método é para isolar uma população de células estaminais a partir de novo os ratos ductos de glândulas submucosas traqueal e para colocar estas células in vitro e em sistemas de modelos in vivo para identificar os mecanismos de reparação e regeneração das glândulas submucosas 3. Isto mostra a produção de métodos que podem ser utilizados para isolar e ensaio das células estaminais e do ducto basal das vias aéreas grandes 3. Isto permitirápara o estudo de doenças das vias respiratórias, como a fibrose cística, asma e doença pulmonar obstrutiva crónica. Actualmente, não existem métodos para o isolamento de células das glândulas submucosas duto e não existem modelos in vivo para estudar a regeneração de glândulas submucosas.

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Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Aqui demonstramos nosso protocolo para isolamento de células basais e das glândulas submucosas duto de traqueias de rato. Nós também demonstram o método de injecção de células estaminais na almofada de gordura dorsal do rato para criar um<em&gt; In vivo</em&gt; Modelo de regeneração da glândula submucosa.

Isolamento de células basais e células Duct submucosa Glândulas de Rato Traquéia

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biologia

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolamento e cultura de células da zona nefrogênica do rim do rato embrionárias

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolamento de células imunes de tumores primários

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...