Name: isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea
Uploaded: 2012-09-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea at JoVE.com

Vi vill erkänna de allmänna Stem Cell FACS Research Center och särskilt tacka Jessica Scholes och Felicia Codrea för deras hjälp med cellsortering. Arbetet har finansierats av CIRM RN2-00.904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / KOL Foundation ATS-06-065, den oro Foundation, UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / lungcancer SPOR, University of California Cancer Forskning samordningskommitté och Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).

Disposition av steg 1. Dissektion av trakea 2. Rengöring luftstrupen och skär den 3. Enzymnedbrytning och bearbetning till enkelcellsuspension 4. Färgning för FACS och sortering 5. Bearbetning sorterade celler för in vivo och in vitro-modeller 1. Dissektion av Luftstrupe <ol><li> Euthanize musen med en intraperitoneal injektion...

<ol>
	<li>Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+functions+of+the+airway+epithelium.">Innate immune functions of the airway epithelium.</a> Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).</li><li>Finkbeiner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathology+of+tracheobronchial+glands.">Physiology and pathology of tracheobronchial glands.</a> Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).</li><li>Hegab, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Stem/Progenitor+Cell+Population+from+Murine+Tracheal+Submucosal+Gland+Ducts+with+Multipotent+Regenerative+Potential.">A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+features+of+airway+surface+epithelial+cells+and+glands.">Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).</li><li>Rock, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).</li><li>Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+identifies+a+subpopulation+of+murine+and+human+prostate+basal+cells+with+stem+cell+characteristics.">Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+an+epithelial+stem/progenitor+cell+hierarchy+in+the+adult+mouse+lung.">Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).</li><li>Inayama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+growth+and+differentiation+of+clones+of+tracheal+basal+cells.">In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells.</a> Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).</li><li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Bronchial+Epithelial+Cells+Differentiate+to+3D+Glandular+Acini+on+Basement+Membrane+Matrix.">Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).</li><li>Ooi, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+putative+tumor-initiating+progenitor+cell+population+predicts+poor+prognosis+in+smokers+with+non-small+cell+lung+cancer.">Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer.</a> Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).</li></ol>

Denna teknik för att isolera kanal och basala celler från luftvägarna är viktig för att förbättra vår förståelse av luftvägarna reparation och förnyelse och lungsjukdom. De metoder som beskrivs här med några viktiga steg. Den första är den optimerade enzymatisk digerering perioden. Den andra är att skapa en enda cell suspension genom seriepassage med successivt högre gage nålar för att förhindra cell klippning utan att bryta upp cellklumpar. Den tredje är den FACS-analys, och gating av celler med l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Komplett medium 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td></tr><tr><td> Hepes (15 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 15.630 </td></tr><tr><td> Natriumbikarbonat (3,6 mM eller 0,03%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25.080 </td></tr><tr><td> L-glutamin (4 mM) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-Cl </td></tr><tr><td> Penicillin (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-Cl </td></tr><tr><td> Streptomycin (100 pg / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-Cl </td></tr><tr><td> Amfotericin B (0,25 | ig / ml) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> ISulin (10 pg / ml) </td><td> Sigma </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrin (5 ng / ml) </td><td> Sigma </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> Koleratoxin (0,1 pg / ml) </td><td> Sigma </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> Epidermal tillväxtfaktor (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354.001 </td></tr><tr><td> Bovinslemavsöndrande extrakt (30 pg / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum (5%) </td><td> Fisher </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> Retinoinsyra (0,05 iM) </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> Tillväxtfaktor Minskad Matrigel </td><td> BD </td><td> 354.230 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Komplett media komponenter. <table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td&gt; <td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 10165921001 </td><td> Används vid 0,15%: -O / N vid 4 ° C matsmältningen att isolera totalt trakeala celler (för ALI kultur) -4 HR digerering 4 ° C för att isolera SMG </td></tr><tr><td> Dispas </td><td> BD Biosciences </td><td> 354.235 </td><td> Används vid 16 enheter: 30 min vid RT </td></tr><tr><td> DNas I </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> Används vid 0,5 mg / ml: 20-30 min vid RT </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Enzymer som används för enzymatisk digestion av luftstrupen.

isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea

Den stora luftvägarna är i direkt kontakt med omgivningen och därför känslig för skador från gifter och smittämnen som vi andas in 1. Den stora luftvägarna kräver därför en effektiv reparation mekanism för att skydda våra kroppar. Denna reparationen sker från stamceller i luftvägarna och isolera dessa stamceller från luftvägarna är viktig för att förstå mekanismerna för reparation och förnyelse. Det är också viktigt för att förstå onormal reparation som kan leda till luftvägssjukdomar 2. Målet med denna metod är att isolera en ny population stamceller från mus trakeala submukosala körtel kanaler och placera dessa celler in vitro och in vivo modellsystem för att identifiera mekanismer reparation och regenerering av submukosala körtlar 3. Denna produktion visar metoder som kan användas för att isolera och analysera de kanal-och basala stamceller från stora luftvägarna 3. Detta kommer att ge ossatt studera sjukdomar i luftvägarna, såsom cystisk fibros, astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom. För närvarande finns det inga metoder för isolering av submukosala gland duct celler och det finns inga in vivo-modeller för att studera regenerering av submukosala körtlar.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea at JoVE.com

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Här visar vi vår protokoll för isolering av basala och submukosal celler körtel kanal från mus trakea. Vi visar också metoden för att injicera stamceller i den dorsala musen fett pad för att skapa en<em&gt; In vivo</em&gt; Modell av submukosal körtel förnyelse.

Isolering av basalceller och submukös körtelceller Duct från mus Luftstrupe

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolering av CD4 + T-celler från Noder Mus Lymph Använda Miltenyi MACS Rening

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolering och Härledning av Mouse Embryonala Germinal celler

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolering av näthinnan stamceller från mus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolering av Mouse Saliv celler Gland Stem

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolering och odling av celler från Nefrogen Zonen av embryonala Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolering av immunceller från primära tumörer

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering och kultur av Dental epitelceller stamceller från vuxen mus Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...