Name: dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Investigação intramuros do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios de Comunicação. Apoio adicional foi fornecido por NIDCD 5R01 DC007613.

1. Dissecção utrículo e Cultura <ol><li> Euthanize um adulto (4 semanas de idade ou mais velhos) do mouse através de um protocolo aprovado e decapitar. </li><li> Cortar o canal auditivo externo em ambos os lados da cabeça e puxar a pele para a frente para o nariz. Bisect a cabeça de trás para a frente e retirar o cérebro de ambos os lados para revelar o labirinto ósseo. </li><li> Aparar o crânio para longe da cóclea óssea e transferir o labirinto ósseo (incluindo a bolha) para um capuz de cultura de tecid...

<ol>
	<li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death.">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. , (2006).</li><li>Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+hair+cell+death+requires+STAT1+and+is+attenuated+by+epigallocatechin+gallate.">Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate.</a> J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).</li><li>Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FDA-approved+drugs+and+bioactives+that+protect+hair+cells+in+the+zebrafish+(Danio+rerio)+lateral+line+and+mouse+(Mus+musculus)+utricle.">Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).</li><li>Chiu, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+lateral+line+to+screen+for+ototoxicity.">Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).</li><li>Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+signaling+in+neomycin-induced+vestibular+hair+cell+death.">JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death.</a> Hear Res. , 221-221 (2006).</li><li>Matsui, J. I., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+hair+cell+death+and+regeneration:+two+halves+of+the+same+equation.">Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).</li><li>Ryals, B. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+after+acoustic+trauma+in+adult+Coturnix+quail.">Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail.</a> Science. 240, 1774-176 (1988).</li><li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma.">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240, 1772-174 (1988).</li><li>Shang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+cell+division+is+not+required+for+regeneration+of+auditory+hair+cells+after+ototoxic+injury+in+vitro.">Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).</li><li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium.">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).</li><li>Lahne, M., Gale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage-induced+activation+of+ERK1/2+in+cochlear+supporting+cells+is+a+hair+cell+death-promoting+signal+that+depends+on+extracellular+ATP+and+calcium.">Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium.</a> J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).</li><li>Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+Activation+in+Hair+Cells+of+the+Mouse+Utricle+Exposed+to+Neomycin.">Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).</li><li>Matsui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors+promote+vestibular+hair+cell+survival+and+function+after+aminoglycoside+treatment+in+vivo.">Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).</li><li>Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+caspases+prevents+ototoxic+and+ongoing+hair+cell+death.">Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death.</a> J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).</li><li>Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+inducing+local+inner+ear+damage.">A novel technique for inducing local inner ear damage.</a> Hear Res. 176, 1-2 (2003).</li><li>Forge, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+death+of+hair+cells+in+mammalian+vestibular+sensory+epithelia.">Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia.</a> Hear Res. 139, 1-2 (2000).</li><li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors+prevent+cisplatin-induced+apoptosis+of+auditory+sensory+cells.">Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells.</a> Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).</li><li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hearing+loss+and+cochlear+hair+cell+death.">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death.</a> Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).</li><li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hair+cell+death+and+is+necessary+for+the+protective+effect+of+heat+shock.">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).</li><li>Francis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celastrol+Inhibits+Aminoglycoside-Induced+Ototoxicity+via+Heat+Shock+Protein+32+(HSP32).">Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32).</a> Cell Death and Disease. , (2011).</li><li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors,+but+not+c-Jun+NH2-terminal+kinase+inhibitor+treatment,+prevent+cisplatin-induced+hearing+loss.">Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss.</a> Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).</li><li>Bird, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+cells+eliminate+dying+sensory+hair+cells+to+maintain+epithelial+integrity+in+the+avian+inner+ear.">Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear.</a> J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).</li><li>Sato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+on+cochlear+macrophages+influences+survival+of+hair+cells+following+ototoxic+injury.">Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).</li></ol>

As células pilosas sensitivas são susceptíveis à morte provocada por uma variedade de tensões, incluindo o envelhecimento, trauma de ruído, e exposição a drogas ototóxicas, incluindo os antibióticos aminoglicósidos e da cisplatina agente antineoplásico. Em mamíferos cabelo resulta de morte celular em perda permanente da audição e / ou distúrbio do equilíbrio. Em sistemas de modelo in vitro são ferramentas importantes para estudos que visem determinar os mecanismos celulares e molecula...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3734">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection</a>. There was an error with a figure, the authors middle names were omitted, and the acknowledgements were updated.

Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de Catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Meio 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine fórceps (# 55)</td&gt;<td&gt; Belas Ferramentas Ciência</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine fórceps (# 5)</td&gt;<td&gt; Belas Ferramentas Ciência</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fórceps (# 3)</td&gt;<td&gt; Belas Ferramentas Ciência</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicilina G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Soro fetal de bovino</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini-bandeja-</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovírus GFP-</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ex-Cal descalcificante</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Boro-hidreto de sódio</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 7 Anti-Miosina (policlonal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 7 Anti-Miosina (monoclonal)</td&gt;<td&gt; Desenvolvimento de Estudos Hybridoma Banco</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calmodulina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-calbindina</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotechnology Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabela 1</strong&gt;. Reagentes e instrumentos utilizados na cultura utrículo e infecção por adenovírus.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Nota: Ad-GFP normalmente é fornecido pelo Biolabs vetor em um título de estoque de 1x10<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Nós solicitada uma amplificação costume, a fim de proporcionar o vírus Estoque a um título de 1,2 × 10<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection

A perda de audição e distúrbios de equilíbrio são frequentemente causada pela morte das células ciliadas mecanosensorial, que são as células receptoras do ouvido interno. Uma vez que não há nenhuma linha de células que satisfatoriamente representa células capilares dos mamíferos, a investigação sobre as células ciliadas depende culturas de órgãos principais. A melhor caracterizados in vitro sistema modelo de células maduras de cabelo de mamíferos utiliza culturas de órgãos de utrículos de ratinhos adultos (Figura 1) 1-6. O utrículo é um órgão vestibular, e as células ciliadas do utrículo são semelhantes em estrutura e função das células ciliadas no órgão auditivo, o órgão de Corti. O adulto preparação utrículo rato representa um epitélio maduro sensorial para os estudos dos sinais moleculares que regulam a sobrevivência, a homeostase e morte dessas células. Mamífero células ciliadas são terminalmente diferenciadas e não são regenerados, quando são perdidos. Em não-mamvertebrados do Mali, auditivas ou morte celular vestibular cabelo é seguido por regeneração robusta que restaura a audição e equilíbrio funções 7, 8. Regeneração de células ciliadas é mediada por células gliais-like células de suporte, que contactam com as superfícies basolateral de células ciliadas no epitélio sensorial 9, 10. Células de suporte são também mediadores importantes da sobrevivência de células ciliadas e morte 11. Recentemente, desenvolveu uma técnica para a infecção de células de suporte em utrículos cultivadas utilizando adenovírus. Usando o adenovírus tipo 5 (dE1/E3) para entregar um transgene contendo GFP sob o controlo do promotor de CMV, descobrimos que o adenovírus especificamente e de forma eficiente infecta células de suporte. Suportando eficiência de infecção de células é de aproximadamente 25-50%, e as células do cabelo não estão infectadas (Figura 2). Importante, descobrimos que a infecção adenoviral de células de suporte não resultar em toxicidade para as células ciliadas ou células de suporte, tal como as contagens de células em Ad-GFP infutrículos ected são equivalentes aos da não-infectadas utrículos (Figura 3). Assim adenovírus mediada por expressão gênica em células de suporte de utrículos cultura fornece uma ferramenta poderosa para estudar os papéis de células de suporte, como mediadores da sobrevivência das células ciliadas, morte e regeneração.

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Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Células ciliadas mecanosensorial são as células receptoras do ouvido interno. A melhor caracterizado<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modelo de células maduras capilares dos mamíferos utiliza culturas de órgãos de utrículos de ratos adultos. Apresentamos a dissecção do utrículo rato adulto, e demonstramos adenovírus mediada por infecção de células de suporte no utrículos cultivadas.

Dissecção da utrículo rato adulto e adenovírus Infecção mediada por células Coadjuvante

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Neurociência

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Fundição vascular cerebral do rato adulto for Imaging 3D e Análise morfológica

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

Dissecção crio-seção da zona subependímal adulta para análise proteome quantitativa precisa e profunda

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...