Name: phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors at JoVE.com

אנו מודים Nobuyuki Onai, היטושי Takizawa ומרקוס Manz לייעוץ יקר. עבודה זו מומנה על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע, השוויצרי סרטן הליגה Fondazione Ticinese לכל la RIcerca sul Cancro.

1. הכנת תרחיף תאים ממח העצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר ולמקם את בעל החיים בסיר נירוסטה ואתנול ספריי 70% על הבטן ועל הגב. איסוף עצם הירך לבין עצם השוק מן הרגליים האחוריות, ואת עמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את כל שאריות ...

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Calvi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425, 841-846 (2003).</li><li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li><li>Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2/angiopoietin-1+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+quiescence+in+the+bone+marrow+niche.">Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche.</a> Cell. 118, 149-161 (2004).</li><li>Essers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458, 904-908 (2009).</li><li>Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+on+hematopoietic+progenitor+cells+stimulate+innate+immune+system+replenishment.">Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment.</a> Immunity. 24, 801-812 (2006).</li><li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135, 1118-1129 (2008).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D., D, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+(HSCs.">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs.</a> J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).</li><li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine/paracrine+stimulation+of+purinergic+receptors+in+osteoblasts:+contribution+of+vesicular+ATP+release.">Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).</li><li>Casati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+cycling+activity+by+ATP.">Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP.</a> Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).</li><li>Bouma, G., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+and+genetic+basis+of+inflammatory+bowel+disease.">The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).</li><li>Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation.">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li></ol>

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח מהיר ומדויק של hematopoiesis בעכברים בודדים (איור 1). זה ניתוח במסגרות ניסיוניות שונות, כולל מודלים Murine של דלקת, אוטואימוניות, כשל חיסוני, מחלות ניווניות, הפרעות מטבוליות וסרטן, מאפשרת מענה את ההשפעה של התנאים פתולוגיים על hematopoiesis. ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100x </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> נתרן פירובט </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> מסננת תא 40 מיקרומטר </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD מכתים פתרון </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> Lyse / לתקן את המאגר </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558049 </td></tr><tr><td> פרם חיץ III </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6.7) </td><td> eBioscience </td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455941 </td></tr><tr><td> C-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171171 </td></tr><tr><td> SCA-1 (D7) </td><td> eBioscience </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcγR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553145 </td></tr><tr><td> Anti-APC microbeads </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> LS עמודות </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors

מח העצם הוא האתר העיקרי שבו HSCs ובוגרת יותר כדוריות הדם אבות השושלת מתגוררים ולהבחין באורגניזם הבוגר. HSCs מהווים אוכלוסייה תא גזע pluripotent דקה של תאים המסוגלים לייצר את כל שושלות תאים דם בפעם חיים 1. דיסקציה המולקולרי של הומאוסטזיס HSCs במח העצם יש השלכות חשובות hematopoiesis, אונקולוגיה ורפואה רגנרטיבית. אנו מתארים את פרוטוקול סימון נוגדנים הניאון הליך gating אלקטרוני cytometry זרימת להבקיע תת אבות היווצרות הדם והפצה HSCs בעכברים בודדים (איור 1). בנוסף, אנו מתארים שיטה בהרחבה להעשיר אבות hematopoietic כמו גם לטווח ארוך (LT) ו לטווח קצר (ST) לשחזר HSCs מ אספו מח עצם השעיות התא על ידי העשרת המגנטי של תאים המבטאים C-Kit. הכנת התא וכתוצאה מכך ניתן להשתמש כדי למיין תת שנבחרו במבחנהבמחקרים תפקודית ב vivo (איור 2). שני osteoblasts trabecular 2,3 ו -4 האנדותל סינוסי מהוות נישות תפקודית התומכים HSCs במח העצם. מספר מנגנונים בנישה osteoblastic, כולל משנה של N-cadherin + osteoblasts 3 ואינטראקציה של הקולטן טירוזין קינאז Tie2 לידי ביטוי HSCs עם angiopoietin-1 ליגנד שלה 5 מסכים בקביעת קפאון HSCs. &quot;מצב שינה&quot; במח העצם הוא חיוני כדי להגן על HSCs מ שכפול תשישות בסופו של דבר על פעילות רכיבה על אופניים יתר 6. גירויים חיצוניים הפועלים על תאים של מערכת החיסון המולדת כגון חיוג כמו ligands הקולטן 7 ו אינטרפרון אלפא-6 יכול גם לגרום ריבוי והתמיינות של HSCs לתוך אבות מסורים השושלת. לאחרונה, אוכלוסיית HSCs עכבר רדומים בתוך לין - C-Kit + SCA-1 + CD150 + CD48 - CD34 - האוכלוסייה תוארה 8. מיון של התאים על ביטוי CD34 מן ההשעיה אבות מועשר hematopoietic התא כמתואר כאן מאפשר בידוד של שניהם שוקט עצמית חידוש LT-HSCs ו ST-HSCs 9. הליך דומה על דלדול של תאים החיוביים השושלת ומיון של LT-HSC עם CD48 ו Flk2 נוגדנים תוארה קודם לכן 10. בדו&quot;ח הנוכחי אנו מספקים פרוטוקול אפיון פנוטיפי ו vivo לשעבר לתא מחזור ניתוח של אבות היווצרות הדם, אשר יכול להיות שימושי עבור ניטור hematopoiesis בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. יתר על כן, אנו מתארים FACS מיון הליך HSCs, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להגדיר את גורמי ומנגנוני ויסות עצמי חידוש שלהם, הרחבת והבחנה בביולוגיה של התא התמרה מבחני אות כמו גם להשתלה.

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors at JoVE.com

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors (Video) | JoVE

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Research

JoVE Journal

Biology

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs (Video) | JoVE

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells (Video) | JoVE

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta (Video) | JoVE

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM (Video) | JoVE

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells (Video) | JoVE

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells (Video) | JoVE

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (Video) | JoVE

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells (Video) | JoVE

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells (Video) | JoVE

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation (Video) | JoVE

זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...