Name: phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00
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我々は、貴重なアドバイスを信行紀夫、仁滝沢とマルクスマンツに感謝します。この作品は、スイス国立科学財団、スイスのがんリーグとFondazione Ticinese当たりラ未公表スルCancroによって資金を供給された。

1。骨髄からの細胞懸濁液の調製<ol><li>マウスを安楽死させると、その腹部と背面にステンレスパンとスプレー70％エタノール中に動物を配置します。後ろ足、と脊柱からの大腿骨と脛骨を収集します。 </li><li>正確に鋭い先端をハサミでとガーゼで足の骨から脊柱からすべての軟組織の残留物を除去する。 50μMβ-メルカプトエタノールを添加した10％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を含むRP...

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Calvi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425, 841-846 (2003).</li><li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li><li>Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2/angiopoietin-1+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+quiescence+in+the+bone+marrow+niche.">Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche.</a> Cell. 118, 149-161 (2004).</li><li>Essers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458, 904-908 (2009).</li><li>Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+on+hematopoietic+progenitor+cells+stimulate+innate+immune+system+replenishment.">Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment.</a> Immunity. 24, 801-812 (2006).</li><li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135, 1118-1129 (2008).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D., D, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+(HSCs.">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs.</a> J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).</li><li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine/paracrine+stimulation+of+purinergic+receptors+in+osteoblasts:+contribution+of+vesicular+ATP+release.">Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).</li><li>Casati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+cycling+activity+by+ATP.">Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP.</a> Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).</li><li>Bouma, G., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+and+genetic+basis+of+inflammatory+bowel+disease.">The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).</li><li>Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation.">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li></ol>

ここで説明する方法は、個々のマウス（ 図1）における造血の迅速かつ正確な分析を可能にします。マウス炎症モデルでは、自己免疫疾患、免疫不全、変性疾患、代謝性疾患および癌を含む様々な実験設定ではこの分析は、造血における病理学的条件の影響に対処することができます。 図3は、電子的にゲートLKSにおける細胞周期活性の分析を示しています。 </su...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>ギブコ</td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100X </td><td>ギブコ</td><td> 11140 </td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>ギブコ</td><td> 11360 </td></tr><tr><td> PenStrep </td><td>ギブコ</td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td>ギブコ</td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td>ギブコ</td><td> 16000 </td></tr><tr><td>セルストレーナーは40μm </td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD染色液</td><td> BD Pharmingen社</td><td> 559925 </td></tr><tr><td>バッファを溶解/修正</td><td> BD Pharmingen社</td><td> 558049 </td></tr><tr><td>バッファIIIをパーマ</td><td> BD Pharmingen社</td><td> 558050 </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> Ki-67の</td><td> BD Pharmingen社</td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td>インビトロジェン</td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4（GK1.5） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8（53から6.7） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3（145-2C11） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R（RA3-6B2） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19（6D5） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 150193 </td></tr><tr><td> GR1（RB6-8C5） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119（TER-119） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1（PK136） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 455941 </td></tr><tr><td>のc-Kit（2B8） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 171171 </td></tr><tr><td> SCA-1（D7） </td><td> eBiosciENCE </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34（RAM34） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcγRと（2.4G2） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 553145 </td></tr><tr><td>抗APC MicroBeadsは</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> LSカラム</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors

骨髄は、造血幹細胞とより成熟した血液細胞系列の前駆細胞が存在すると成人生体内で分化する主要なサイトです。造血幹細胞は、生命時間1のすべての血液細胞系列を生成することができる多能性細胞の分細胞集団を構成しています。骨髄中の造血幹細胞恒常性の分子解剖は、造血、腫瘍学、再生医療において重要な意味を持っています。我々は個々のマウス（ 図1）造血前駆細胞サブセットと造血幹細胞の分布を獲得するためにフローサイトメトリーで蛍光抗体、電子ゲートの手順でラベルプロトコルを記述します。加えて、我々は広範囲に造血前駆細胞と同様に長期的（LT）およびc-Kitを発現する細胞の磁気濃縮によりプールされた骨髄細胞懸濁液から造血幹細胞を再構成する短期（ST）を豊かにする方法について説明します。得られた細胞調製物は、in vitroで選択したサブセットをソートするために使用することができ、生体機能研究である（ 図2）。 両方の海綿骨芽細胞2,3と類 ​​洞内皮4は、骨髄中の造血幹細胞をサポートする機能的なニッチを構成しています。そのリガンドであるアンジオポエチン-1 5とN-カドヘリン+骨芽細胞3とHSCで発現する受容体チロシンキナーゼTie2の相互作用のサブセットを含む、骨芽細胞ニッチのいくつかのメカニズムは、造血幹細胞の休止を決定する際に同意する。骨髄中の&quot;休止状態&quot;は、レプリケーションや過度のサイクリング活動の6時の最終的な疲労から造血幹細胞を保護するために重要である。そのようなToll様受容体リガンドとしての自然免疫系の細胞7、インターフェロン-α6に作用する外因性の刺激はまた系統コミットされた前駆細胞に造血幹細胞の増殖と分化を誘導することができる。最近では、LIN内で休眠中のマウスの造血幹細胞の集団-のc-Kit + Sca-1は+ CD150 + CD48 - CD34 -人口が8に記載されています。ここで説明したように造血前駆細胞に富む細胞懸濁液からCD34の発現に基づいてセルの並べ替えは、静止自己再生LT-HSCとST-HSCの9の両方の分離を可能にします。系統陽性細胞の枯渇とCD48とFlk2抗体とLT-HSCのソートに基づいて同様の手順では、以前に10に記載されている。本報告では、表現型の特性と異なる生理学的および病理学的条件下で造血を監視するために有用である造血前駆細胞のex vivoでの細胞周期解析のためのプロトコルを提供しています。さらに、細胞生物学、シグナル伝達アッセイと同様に移植のために彼らの自己再生、拡大と分化を制御する要因とメカニズムを定義するために使用することができ造血幹細胞、の手順をソートFACSを説明します。

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Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit +細胞と細胞および分子研究のための造血幹細胞を精製するために細胞選別の磁気濃縮に基づいています。

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

造血幹細胞の分離と移植（造血幹細胞）

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

マウス卵黄嚢とAGMから早期の造血幹細胞の分離

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...