Name: phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00
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Damos las gracias a Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa y Manz Markus de preciosos consejos. Este trabajo fue financiado por la Swiss National Science Foundation, la Liga Suiza contra el Cáncer y la Fundación per la Ricerca Ticinese sul Cancro.

1. Preparación de la suspensión de la célula de la médula ósea <ol><li> Practicar la eutanasia con el ratón y colocar al animal en una sartén inoxidable y el etanol de pulverización 70% sobre su abdomen y la espalda. Recoger fémur y la tibia de las patas traseras, y la columna vertebral. </li><li> Con precisión todos los residuos de los tejidos blandos de la columna vertebral con unas tijeras de punta afilados y de los huesos de las piernas con una gasa. Huesos en tienda a un tubo Falcon de 50 ml con 30 ml d...

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	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Calvi, L. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation.">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li></ol>

El método aquí descrito permite el análisis rápido y preciso de la hematopoyesis en ratones individuales (Figura 1). Este análisis en diversos parámetros experimentales, incluidos los modelos murinos de inflamación, autoinmunidad, inmunodeficiencia, enfermedades degenerativas, trastornos metabólicos y el cáncer, permite abordar el impacto de las condiciones patológicas en la hematopoyesis. La Figura 3 muestra el análisis de la actividad de las células en el ciclo de LKS elec...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM AANE 100X </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> Penstrep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Filtro de la célula 40 micras </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD Solución colorante </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> Lyse / Fix tampón </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558049 </td></tr><tr><td> Perm tampón III </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6,7) </td><td> eBioscience </td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455941 </td></tr><tr><td> c-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171171 </td></tr><tr><td> Sca-1 (D7) </td><td> eBioscicia </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcγR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553145 </td></tr><tr><td> Anti-APC MicroBeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> Columnas LS </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors

La médula ósea es el lugar principal donde las CMH y más maduras las células sanguíneas progenitoras de linaje residen y se diferencian en un organismo adulto. CMH constituyen una población de células minuto de células pluripotentes, capaces de generar todos los linajes de células sanguíneas para un tiempo de vida 1. La disección molecular de la homeostasis del CMH en la médula ósea tiene implicaciones importantes en la hematopoyesis, oncología y medicina regenerativa. Se describe el protocolo de etiquetado con anticuerpos fluorescentes y el procedimiento de puerta electrónica en citometría de flujo para anotar subconjuntos progenitoras hematopoyéticas y distribución HSCs en ratones individuales (Fig. 1). Además, se describe un método para enriquecer ampliamente progenitores hematopoyéticos, así como a largo plazo (LT) ya corto plazo (ST) la reconstitución de HSCs agrupados de suspensiones de células de médula ósea por enriquecimiento magnética de las células que expresan c-kit. La preparación de células resultante se puede utilizar para ordenar los subconjuntos seleccionados para in vitro een estudios in vivo funcionales (fig. 2). Tanto los osteoblastos trabeculares 2,3 y 4 endotelio sinusoidal constituyen nichos funcionales de apoyo CMH en la médula ósea. Hay varios mecanismos que en el nicho de los osteoblastos, como un subconjunto de N-cadherina + 3 osteoblastos y la interacción de la Tie2 tirosina quinasa del receptor se expresa en las CMH con su angiopoyetina-1 ligando 5 de acuerdo en la determinación de la quietud CMH. &quot;Hibernación&quot; en la médula ósea es crucial para proteger a las HSCs de replicación y eventual agotamiento en la actividad un ciclo excesivo 6. Estímulos exógenos que actúan sobre las células del sistema inmune innato como ligandos de los receptores Toll-like 7 y el interferón-alfa 6 también se puede inducir la proliferación y diferenciación de las CEH en el linaje de los progenitores comprometidos. Recientemente, una población de HSC de ratón latentes dentro de la lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - la población ha sido descrito 8. Clasificación de las células CD34 sobre la base de expresión de la suspensión de células hematopoyéticas progenitoras enriquecido como se ha descrito aquí permite el aislamiento de ambos quiescente autorrenovación LT-HSC y ST-CMH 9. Un procedimiento similar basado en el agotamiento de linaje de células positivas y la clasificación de LT-HSC con CD48 y Flk2 anticuerpos ha sido descrita previamente 10. En el presente informe se proporciona un protocolo para la caracterización fenotípica y ex vivo de células análisis del ciclo de progenitores hematopoyéticos, que pueden ser útiles para el seguimiento de la hematopoyesis en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Además, se describe un FACS sorting procedimiento para CMH, que pueden ser utilizados para definir los factores y mecanismos que regulan su auto-renovación, expansión y diferenciación en la biología celular y ensayos de transducción de señales, así como para el trasplante.

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Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC)

Investigación

Biología

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Aislamiento y análisis de las células madre hematopoyéticas de la placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

El aislamiento de las primeras células madre hematopoyéticas murinas saco vitelino y AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identificación de los factores clave que regula la auto-renovación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas EML por análisis de secuenciación de ARN-

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...