Name: phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors at JoVE.com

Vi tackar Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa och Markus Manz för värdefulla råd. Detta arbete har finansierats av schweiziska National Science Foundation, Schweiz Cancer League och Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro.

1. Framställning av cellsuspension från benmärg <ol><li> Euthanize musen och placera djuret i en rostfri kastrull och spraya 70% etanol på sin mage och rygg. Samla lårben och skenben från bakbenen och ryggraden. </li><li> Noggrant bort alla mjukdelar rester från ryggraden med en vass spets sax och från ben ben med en gasbinda. Lagra ben i en 50 ml Falcon-rör med 30 ml RPMI-medium innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), kompletterat med 50 | iM β-merkaptoetanol, 100 | iM MEM icke-essent...

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Calvi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425, 841-846 (2003).</li><li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li><li>Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2/angiopoietin-1+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+quiescence+in+the+bone+marrow+niche.">Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche.</a> Cell. 118, 149-161 (2004).</li><li>Essers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458, 904-908 (2009).</li><li>Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+on+hematopoietic+progenitor+cells+stimulate+innate+immune+system+replenishment.">Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment.</a> Immunity. 24, 801-812 (2006).</li><li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135, 1118-1129 (2008).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D., D, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+(HSCs.">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs.</a> J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).</li><li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine/paracrine+stimulation+of+purinergic+receptors+in+osteoblasts:+contribution+of+vesicular+ATP+release.">Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).</li><li>Casati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+cycling+activity+by+ATP.">Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP.</a> Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).</li><li>Bouma, G., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+and+genetic+basis+of+inflammatory+bowel+disease.">The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).</li><li>Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation.">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li></ol>

Den metod som beskrivs här möjliggör snabb och noggrann analys av hematopoies i individuella möss (figur 1). Denna analys i olika experimentella inställningar, inklusive musmodeller av inflammation, autoimmunitet, immunbrist, degenerativa sjukdomar, metabola sjukdomar och cancer kan ta itu med konsekvenserna av patologiska tillstånd på blodbildningen. Figur 3 visar analysen av cellcykeln aktivitet på elektronisk gated LKS CD34 - celler från friska möss ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42.401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100X </td><td> Gibco </td><td> 11.140 </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11.360 </td></tr><tr><td> Penstrep </td><td> Gibco </td><td> 15.070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20.012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16 tusen </td></tr><tr><td> Cellfilter 40 | im </td><td> BD Falcon </td><td> 352.340 </td></tr><tr><td> 7-AAD Färgningslösning </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559.925 </td></tr><tr><td> Lyse / Fix buffert </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558.049 </td></tr><tr><td> Perm buffert III </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558.050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556.026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150.041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6,7) </td><td> eBioscience </td><td> 150.081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150.031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150.452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150.193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155.931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155.921 </td></tr><tr><td> NK-1,1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455.941 </td></tr><tr><td> c-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171.171 </td></tr><tr><td> Sca-1 (D7) </td><td> eBiosciENCE </td><td> 135.981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110.341 </td></tr><tr><td> FcyR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553.145 </td></tr><tr><td> Anti-APC Mikropärlor </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> LS kolumner </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors

Benmärgen är den viktigaste platsen där HSC och mer mogna blodkroppar härstamning progenitorer bor och differentierar i en vuxen organism. HSC utgör en minut cellpopulation av pluripotenta celler med förmåga att generera alla blodcellinjer under en livstid 1. Den molekylära dissektion av HSC homeostas i benmärgen har viktiga följder i blodbildningen, onkologi och regenerativ medicin. Vi beskriver märkningen protokollet med fluorescerande antikroppar och den elektroniska gating förfarandet i flödescytometri att göra mål hematopoetiska progenitorceller delmängder och HSC distribution i enskilda möss (Fig. 1). Dessutom beskriver vi en metod för att omfattande berika hematopoetiska progenitorceller och lång sikt (LT) och kortsiktiga (ST) rekonstituering HSC från poolade celler från benmärg suspensioner genom magnetisk anrikning av celler som uttrycker c-Kit. Den resulterande cellen preparatet kan användas för att sortera valda underuppsättningar för in vitro-ochin vivo funktionella studier (fig. 2). Båda trabekulära osteoblaster 2,3 och sinusformad endotelet 4 utgör funktionella nischer stöd HSC i benmärgen. Flera mekanismer i den osteoblastiska nisch, inklusive en deluppsättning av N-cadherin + osteoblaster 3 och interaktion av receptorn tyrosinkinas Tie2 uttryckt i HSC: er med dess ligand angiopoietin-1 5 sammanfaller vid bestämning HSC: er vila. &quot;Viloläge&quot; i benmärgen är avgörande för att skydda HSC från replikering och slutligen utmattning efter alltför cykla aktivitet 6. Exogena stimuli som verkar på celler i det medfödda immunförsvaret som Toll-like receptor ligander 7 och interferon-a-6 kan också inducera proliferation och differentiering av HSC i härstamning stamceller. Nyligen en population av vilande mus HSC inom lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - befolkningen har beskrivits 8. Sortering av celler baserat på CD34-uttryck från den hematopoetiska progenitorer-anrikade cellsuspension som beskrivits här möjliggör isolering av både vilande självförnyande LT-HSC: er och ST-HSC: er 9. Ett liknande förfarande baserat på förbrukningen av härstamning positiva celler och sortering av LT-HSC med CD48 och Flk2 antikroppar har tidigare beskrivits 10. I denna rapport ger vi ett protokoll för fenotypiska karakterisering och ex vivo cellcykeln analys av hematopoetiska stamceller, vilka kan vara användbara för övervakning hematopoes i olika fysiologiska och patologiska tillstånd. Dessutom beskriver vi en FACS sortering förfarande för HSC, som kan användas för att definiera faktorer och mekanismer som reglerar deras självförnyelse, expansion och differentiering i cell biologi och signal analyser transduktionsmekanismer samt för transplantation.

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors at JoVE.com

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

En metod för att analysera fördelningen av benmärgsceller hematopoietiska progenitorer i flödescytometri samt att effektivt isolera höggradigt renade hematopoietiska stamceller (HSC: er) beskrivs. Isoleringen Förfarandet är i huvudsak baserad på magnetiska anrikning av c-Kit + celler och cell sortering för att rena HSC för cellulära och molekylära studier.

Fenotypisk analys och isoleringen av murina hematopoietiska stamceller och Linjen-bundna stamfäder

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolering och transplantation av hematopoetiska stamceller (HSCs)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolering och analys av hematopoetiska stamceller från moderkakan

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Isolering av tidiga hematopoetiska stamceller från Murine gulesäcken och årsstämma

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-medierad Knockdown Under Ex vivo Erytropoes av mänskliga hematopoetiska stamceller

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolering, kultur, och transplantation av muskelsatellitceller

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Retroviral infektion av murina embryonal stamcells Härstammar Embryoid kroppens celler för analys av hematopoetiska Differentiering

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identifiering av nyckelfaktorer Reglersjälvförnyelse och differentiering i EML Hematopoietisk prekursorceller genom RNA-sekvensering analys

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...