Name: phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors at JoVE.com

Biz değerli tavsiye için Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa ve Markus Manz teşekkür ederiz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, İsviçre Kanser Ligi ve Fondazione Ticinese başına la RIcerca sul Cancro tarafından finanse edildi.

1. Kemik İliği gelen Hücre Süspansiyon hazırlanması <ol><li> Fare Euthanize ve karın ve geriye doğru olan paslanmaz pan ve sprey% 70 etanol içinde hayvan yerleştirin. Femur ve tibia arka bacak ve omurga toplayın. </li><li> Doğru sivri uçlu makasla ve bir gazlı bez ile bacak kemiklerinden omurga tüm yumuşak doku artıkları çıkarın. 50 uM β-merkaptoetanol, 100 uM MEM olmayan amino asitler ile desteklenmiş% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), 1 mM sodyum piruvat MEM, 2 içeren R...

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Calvi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425, 841-846 (2003).</li><li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li><li>Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2/angiopoietin-1+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+quiescence+in+the+bone+marrow+niche.">Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche.</a> Cell. 118, 149-161 (2004).</li><li>Essers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458, 904-908 (2009).</li><li>Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+on+hematopoietic+progenitor+cells+stimulate+innate+immune+system+replenishment.">Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment.</a> Immunity. 24, 801-812 (2006).</li><li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135, 1118-1129 (2008).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D., D, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+(HSCs.">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs.</a> J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).</li><li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine/paracrine+stimulation+of+purinergic+receptors+in+osteoblasts:+contribution+of+vesicular+ATP+release.">Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).</li><li>Casati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+cycling+activity+by+ATP.">Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP.</a> Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).</li><li>Bouma, G., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+and+genetic+basis+of+inflammatory+bowel+disease.">The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).</li><li>Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation.">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li></ol>

Burada anlatılan yöntem tek tek fareleri (Şekil 1) in hematopoiesis hızlı ve doğru analizine olanak tanır. Fare inflamasyon modelleri, otoimmünite, immün yetmezlik, dejeneratif hastalıklar, metabolik hastalıklar ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli deneysel ayarları, bu analiz hematopoiezis patolojik durumun etkisini ele veriyor. Şekil 3 elektronik kapılı LKS üzerinde hücre bisiklet aktivitesi analizini gösterir CD34 - Ki-67 mab ve DAPI ile...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100X </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Hücre Süzgeç 40 mikron </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD Boyama çözüm </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> Tampon Lyse / Fix </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558049 </td></tr><tr><td> Tampon III Perm </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6,7) </td><td> eBioscience </td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455941 </td></tr><tr><td> c-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171171 </td></tr><tr><td> Sca-1 (D7) </td><td> eBiosciğımız uydunun </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcγR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553145 </td></tr><tr><td> Anti-APC mikroküreler </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> LS Sütunlar </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors

Kemik iliği HKH&#39;ler ve daha olgun kan hücrelerinin soy ataları ikamet ve yetişkin bir organizmanın bir farklılaşmanın temel sitedir. HKH&#39;lerin ömür boyu 1 için tüm kan hücre soylarının yaratabilmeleridir pluripotent hücrelerin bir dakika hücre popülasyonu oluşturmaktadır. Kemik iliğindeki HKH&#39;ler homeostazının moleküler diseksiyonu hematopoezisi, onkoloji ve rejeneratif tıp açısından önemli olmaktadır. Biz floresan antikor ve bireysel farelerde hematopoetik progenitör alt ve HKH&#39;lerin dağılımı (Şekil 1) puan almak için akım sitometri içinde elektronik yolluk prosedürü ile etiketleme protokolü tanımlar. Ayrıca, yaygın hematopoietik öncü yanı sıra uzun vadeli (LT) ve c-Kit eksprese eden hücrelerin manyetik zenginleştirme tarafından toplanan kemik iliği hücre süspansiyonları gelen HKH&#39;ler yeniden yapılandırılması kısa vadeli (ST) zenginleştirmek için bir metodu tanımlar. Elde edilen hücre hazırlanması için in vitro olarak seçilen alt sıralamak ve etmek için kullanılabilirİn vivo çalışmalar işlevsel (Şekil 2). Hem trabeküler osteoblastlar 2,3 ve sinüzoidal endotel 4 kemik iliğinde HKH&#39;ler destekleyen fonksiyonel niş oluşturmaktadır. N-kaderin + osteoblastlar 3 alt ve ligand anjiyopoietin-1 5 ile HKH&#39;ler ifade reseptör tirozin kinaz Tie2 etkileşimi de dahil olmak üzere osteoblastik niş içinde çeşitli mekanizmalar HKH&#39;ler sessizliğini belirlenmesinde hemfikir. Kemik iliğinde &quot;Hazırda&quot; aşırı bisiklet aktivitesi üzerine 6 çoğaltma ve sonunda yorgunluktan HKH&#39;ler korumak için çok önemlidir. Böyle Toll-like reseptör ligandlar 7 ve interferon-α 6 gibi doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerinde etkili eksojen uyarılara da soyu adamış ataları içine yayılması ve HKH&#39;lerin ayrımı uyarabilir. Son zamanlarda, lin içinde uyuyan fare HKH&#39;ler nüfusu - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - nüfusu 8 tarif edilmiştir. Hücrelerin Sıralama burada açıklandığı gibi hematopoietik öncü zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu ile CD34 ekspresyonunun dayalı sağlar sakin kendini yenileyen LT-HKH&#39;ler ve ST-HKH&#39;ler 9 hem de izolasyon. Soyu pozitif hücrelerinin tükenmesine ve CD48 ve Flk2 antikorları ile birlikte LT-KYH sıralama göre benzer bir prosedür, daha önce 10 tarif edilmiştir. Bu yazıda fenotipik karakterizasyonu ve farklı fizyolojik ve patolojik şartlarda hematopoez izlemek için yararlı olabilir hematopoietik öncü, ex vivo hücre döngüsü analizi için bir protokol sağlar. Ayrıca, biz faktörleri ve hücre biyolojisi ve sinyal iletimi deneyleri yanı sıra transplantasyon için kendi kendini yenileme, genişleme ve farklılaşma düzenleyen mekanizmaları tanımlamak için kullanılabilir HKH&#39;ler, prosedürü sıralama bir FACS açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors at JoVE.com

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH&#39;ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH&#39;ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

İzolasyon ve Hematopoetik Kök Hücre Transplantasyonu (HKH&#39;lerin)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Murin Yolk Sac ve AGM Erken Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...