Name: quantitative imaging of lineage-specific toll-like receptor-mediated signaling in monocytes and dendritic cells from small samples of human blood
Uploaded: 2012-04-16T13:00:00
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Diese Arbeit wurde zum Teil durch die NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, und die NCRR / GCRC Programm M01-RR00125) unterstützt. Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen und danken Herrn Dr. Mark Shlomchik, Direktor des Yale Cell Sorter Core Facility.

1. Isolierung und Stimulation von Immunzellen <ol><li> Erhalten 10-50 ml heparinisierten Blut von gesunden Freiwilligen nach schriftlicher Einwilligung unter den Richtlinien der lokalen Institutional Review Board. Bei Studien von Alterung oder Pathogenese der Erkrankung, Exklusion und Inklusion Kriterien für jeden Freiwilligen oder Patienten müssen explizit bestimmt werden. </li><li> Isolieren menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mit CPT-Röhrchen oder Ficoll-Paque Plus nach den Anweisungen des ...

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	<li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li><li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging.">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+innate+immunity.">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li><li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression.">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li><li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response.">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li><li>Kong, K. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly.">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus.">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+immunobiology.">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly.">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li><li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow.">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li></ol>

Die entscheidenden Schritte bei der Verwendung von ImageStream für translationale Studien sind die Auswahl der relevanten Vergleichsgruppen und Optimierung und Validierung von Antikörper-Spezifität. Unterschiede zwischen Fächergruppen in dem markierten Ziel wird leicht ersichtlich sein durch Histogramme und Zellen geben. In Kombination mit einer gründlichen Analyse der Veränderungen in relevanten Rezeptoren und Signalwege, werden diese Daten wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die in spezialisierten Immundysre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus- </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> R848 </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-r848 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd (16%) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> BD Perm / Wash </td><td> BD Biosciences </td><td> 554723 </td></tr><tr><td> CD14-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-0149-41 </td></tr><tr><td> CD4-PacBlue </td><td> BD Pharmingen </td><td> 68436 </td></tr><tr><td> Lineage-Cocktail 1 (lin 1)-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340546 </td></tr><tr><td> CD11c-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 347637 </td></tr><tr><td> CD123-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340545 </td></tr><tr><td> Kaninchen-Anti-NF-kB (p65) </td><td> SantaCruz </td><td> SC-372 </td></tr><tr><td> Alexa647 F (ab &#39;) 2 Ziege-anti-Kaninchen-IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A21246 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Spezifischen Reagenzien und Geräte. <table border="1"><tbody><tr><td> Zelltyp </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> Alexa 647 </td><td> PacBlue </td></tr><tr><td> Monozyten </td><td></td><td> CD14 </td><td> NF-kB (p65) </td><td></td></tr><tr><td> mDC </td><td> Lin1 </td><td> CD11c </td><td> NF-kB (p65) </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> pDC </td><td> Lin1</td><td> CD123 </td><td> NF-kB (p65) </td><td> CD4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Antikörper Platte für Zellreihe Färbung von Signalwegen Monozyten: CD14 + MDC: Lin1-, CD4dim, CD11c + PDC: Lin1-, CD4dim, CD123 + Lin1 (Abstammung) Marker enthält CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 Marker für Monozyten, NK-Zellen, T &amp; B-Zellen.

quantitative imaging of lineage-specific toll-like receptor-mediated signaling in monocytes and dendritic cells from small samples of human blood

Individuelle Abweichungen in Immunstatus bestimmen Reaktionen auf Infektionen und zur Schwere der Erkrankung und das Ergebnis. Das Altern ist mit einer erhöhten Anfälligkeit für virale und bakterielle Infektionen assoziiert und verringerte Ansprechbarkeit auf Impfstoffe mit einer gut dokumentierten Rückgang in humorale als auch zellvermittelte Immunreaktionen 1,2. Wir haben vor kurzem die Auswirkungen der Alterung auf die Toll-like Rezeptoren (TLR), wichtige Bestandteile des angeborenen Immunsystems, die mikrobielle Infektion und Trigger mikrobiellen Abwehr Antworten 3 erkennen beurteilt. In einer großen Kohorte von gesunden menschlichen Spendern, haben wir gezeigt, dass die Monozyten im peripheren Blut von älteren Menschen haben die Expression und Funktion bestimmter TLR 4 und ähnlich reduzierte TLR Ebenen und Signalantwort in dendritische Zellen (DCs) verringerte, Antigen-präsentierende Zellen, die entscheidend sind in die Verknüpfung zwischen angeborenen und erworbenen Immunität 5. Wir haben eine Fehlregulation von TLR3 in Makrophagen gezeigt, eind niedrigere Produktion von IFN durch DCs von älteren Spendern in Reaktion auf eine Infektion mit West-Nil-Virus 6,7. Paramount zu unserem Verständnis der Immunoseneszenz und therapeutische Intervention ist ein detailliertes Verständnis der spezifischen Zelltypen reagieren und der Mechanismus (s) der Signaltransduktion. Traditionelle Studien von Immunantworten durch bildgebende von primären Zellen und Vermessung Zellmarker durch FACS oder Immunoblot haben unser Verständnis deutlich, rückte aber diese Studien in der Regel mit technischen Mitteln durch die kleine Stichprobe zur Verfügung stehende Volumen von Patienten und die Unfähigkeit, komplexe Laborverfahren auf mehreren befragen begrenzt humanen Proben. ImageStream kombiniert quantitative Durchflusszytometrie bei gleichzeitiger hoher Auflösung digital imaging und erleichtert somit die Untersuchung in mehreren Zellpopulationen gleichzeitig für eine effiziente Erfassung von Patienten-Anfälligkeit. Hier zeigen wir die Verwendung von ImageStream in DCs zu beurteilen, TLR7 / 8Aktivierung-vermittelten Anstieg der Phosphorylierung und die nukleäre Translokation von einem Schlüssel Transkriptionsfaktors NF-kB, die die Transkription zahlreicher Gene, die für Immunantworten 8 initiiert. Mit dieser Technologie haben wir vor kurzem auch eine bisher unbekannte Veränderung TLR5 Signalisierung und der NF-kappaB Signalweg in Monozyten von älteren Spendern, die zu einer veränderten Immunantwort in alternden 9 beitragen können, unter Beweis gestellt.

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Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Wir beschreiben den Einsatz von ImageStream Technologie (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"&gt; Www.amnis.com</a&gt;), Verbindet die quantitative Durchflusszytometrie bei gleichzeitiger hoher Auflösung digital imaging, um zelluläre Mechanismen der primären Immunzellen aus gut definierten Patientengruppen zu quantifizieren. Unsere Studien liefern eine Blaupause für translationale Untersuchungen zur Abstammung spezifische zelluläre Reaktionen in kleinen Proben von Kohorten Thema zu quantifizieren.

Quantitative Bildgebung von Lineage-spezifischen Toll-like Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion in Monozyten und dendritischen Zellen aus kleinen Proben des menschlichen Blutes

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Erkennung von Neu1 Sialidase-Aktivität bei der Regulierung der Toll-like-Rezeptor-Aktivierung

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...