Name: quantitative imaging of lineage-specific toll-like receptor-mediated signaling in monocytes and dendritic cells from small samples of human blood
Uploaded: 2012-04-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, והתכנית NCRR / GCRC M01-RR00125). החוקרים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים ותודה ד&quot;ר מארק Shlomchik, מנהל מתקן סדרן נייד Core ייל.

1. בידוד וגירוי של תאים חיסוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג 10-50 מ&quot;ל דם heparinized ממתנדבים בריאים לאחר הסכמה מדעת בכתב לפי הנחיות הדירקטוריון סקירה מקומית המוסדי. ללימודים של הזדקנות או מחלות, הפתוגנזה הדרה קריטריוני ההכללה של כל מתנדב או המ...

<ol>
	<li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li><li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging.">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+innate+immunity.">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li><li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression.">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li><li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response.">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li><li>Kong, K. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly.">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus.">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+immunobiology.">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly.">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li><li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow.">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li></ol>

השלבים הקריטיים השימוש ImageStream ללימודים של תרגום הם הבחירה של קבוצות השוואה רלוונטיות אופטימיזציה ואימות של סגוליות נוגדנים. הבדלים בין קבוצות נושא היעד שכותרתו תהיה ברורה ממבט ראשון באמצעות היסטוגרמות ותמונות סלולריים. בשילוב עם ניתוח מעמיק של שינויים הקולטנים רל?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque פלוס </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> R848 </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-r848 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (16%) </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> BD פן / לשטוף </td><td> BD Biosciences </td><td> 554723 </td></tr><tr><td> CD14-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-0149-41 </td></tr><tr><td> CD4-PacBlue </td><td> BD Pharmingen </td><td> 68436 </td></tr><tr><td> קוקטייל השושלת 1 (לין 1), FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340546 </td></tr><tr><td> CD11c-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 347637 </td></tr><tr><td> CD123-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340545 </td></tr><tr><td> הארנב נגד NF-κB (p65) </td><td> SantaCruz </td><td> SC-372 </td></tr><tr><td> Alexa647 F (&#39;א.ב.) 2 עז נגד ארנב IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A21246 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. ריאגנטים ספציפיים וציוד. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סוג התא </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> Alexa 647 </td><td> PacBlue </td></tr><tr><td> מונוציטים </td><td></td><td> CD14 </td><td> NF-κB (p65) </td><td></td></tr><tr><td> MDC </td><td> Lin1 </td><td> CD11c </td><td> NF-κB (p65) </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> PDC </td><td> Lin1</td><td> CD123 </td><td> NF-κB (p65) </td><td> CD4 </td></tr></tbody></table> 2. לוח נוגדן פאנל עבור מכתים תא השושלת של מסלולי איתות מונוציטים: CD14 + MDC: Lin1-, CD4dim, CD11c + PDC: Lin1-, CD4dim, CD123 + Lin1 (שושלת) סמן כולל CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 סמנים עבור מונוציטים, תאים NK, תאים T &amp; B.

quantitative imaging of lineage-specific toll-like receptor-mediated signaling in monocytes and dendritic cells from small samples of human blood

וריאציות אישיות במעמד החיסון לקבוע התגובות זיהום ולתרום חומרת המחלה ואת התוצאה. הזדקנות קשורה לרגישות מוגברת לזיהומים ויראליים וחיידקים וירידה ההיענות לחיסונים עם ירידה מתועד היטב על הלחות כמו גם התא בתיווך החיסונית 1,2 התגובות. יש לנו העריכו לאחרונה את השפעות ההזדקנות על חיוג כמו קולטנים (TLRs), רכיבים מרכזיים של מערכת החיסון המולדת, כי לזהות זיהום מיקרוביאלי ו מיקרוביאלית טריגר מארח הגנה התגובות 3. בכל קבוצה גדולה של תורמים אנושיים בריאים, הראינו כי מונוציטים בדם הפריפרי של הקשישים ירדו ביטוי ותפקוד של TLRs מסוימים דומים רמות 4 ו TLR מופחת ותגובות איתות תאים דנדריטים (DCS), אנטיגן, הצגת תאים שהם מרכזי הקשר בין חסינות מולד אדפטיבית 5. הראינו dysregulation של TLR3 ב מקרופאגיםד ייצור נמוך של אינטרפרון על ידי DCS מתורמים קשישים בתגובה לזיהום עם וירוס הנילוס המערבי 6,7. Paramount להבנת immunosenescence כדי התערבות טיפולית היא הבנה מפורטת של סוגי תאים מסוימים להגיב מנגנון (ים) של התמרה האות. מחקרים המסורתיים של התגובה החיסונית באמצעות הדמיה של תאים ראשוניים סמנים תא מדידות על ידי FACS או immunoblot קידמו את ההבנה שלנו באופן משמעותי, לעומת זאת, מחקרים אלה מוגבלים בדרך כלל טכנית, על פי היקף המדגם הקטן זמינים חולים וחוסר יכולת לבצע טכניקות מעבדה מורכבות על מספר רב של אדם דגימות. ImageStream משלב cytometry זרימת כמותית עם סימולטני ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית, ובכך מקלה על החקירה אוכלוסיות תאים מרובים ההתרחשויות ללכוד יעיל של רגישות החולה. כאן אנו מדגימים את השימוש ImageStream ב DCS להעריך TLR7 / 8הפעלת בתיווך עליות זירחון ו טרנסלוקציה הגרעין של גורם שעתוק מפתח, NF-κB, אשר יוזם שעתוק של גנים רבים הם קריטיים עבור המערכת החיסונית 8. באמצעות טכנולוגיה זו, יש לנו גם הפגינו לאחרונה שינוי מוכרים קודם לכן של TLR5 איתות מסלול NF-κB ב מונוציטים מתורמים מבוגרים שעשוי לתרום התגובה החיסונית להשתנות ההזדקנות 9.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood at JoVE.com

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

אנו מתארים שימוש בטכנולוגיה ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"&gt; Www.amnis.com</a&gt;), המשלבת cytometry זרימת כמותית עם סימולטני ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית, לכמת המנגנונים התאיים של תאים חיסוניים ראשוניים של קבוצות מוגדרות היטב המטופל. המחקרים שלנו לספק תכנית לחקירות של תרגום לכמת ספציפיים השושלת התגובות הסלולר בדגימות קטנות מקבוצות הנושא.

הדמיה כמותי של שושלת ספציפית חיוג כמו קולטן בתיווך איתות מונוציטים ותאים דנדריטים של דגימות קטנות של דם אנושי

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

איתור פעילות Neu1 Sialidase בוויסות חיוג כמו הפעלת קולטן

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

בידוד של תאים דנדריטים האדם באיברי הרבייה הנקביים ללימודי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונלי

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...