Name: quantitative imaging of lineage-specific toll-like receptor-mediated signaling in monocytes and dendritic cells from small samples of human blood
Uploaded: 2012-04-16T13:00:00
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이 작품은 NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089,992, 그리고 NCRR / GCRC 프로그램 M01-RR00125)에 의해 부분적으로 지원되었다. 저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않고 박사 마크 Shlomchik, 예일 세포 분류기 핵심 시설의 이사 감사합니다.

1. 면역 세포의 분리 및 자극 <ol><li> 지역 기관 검토위원회의 지침하에 작성된 정보에 동의 후 건강한 자원자에서 10-50 ML heparinized 혈액을 구합니다. 노화 또는 질병의 연구를 위해 각 자원이나 환자에 대한 pathogenesis, 배제와 포함 조건은 명시적으로 결정되어야합니다. </li><li> CPT 튜브 또는 Ficoll-Paque을 사용하는 플러스 격리 7 (시약, 표 1) 당일 제조 업체의 지침 (GE 헬스케어, ?...

<ol>
	<li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li><li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging.">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+innate+immunity.">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li><li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression.">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li><li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response.">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li><li>Kong, K. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly.">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus.">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+immunobiology.">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly.">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li><li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow.">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li></ol>

translational 연구를위한 ImageStream의 사용에서 중요한 단계는 관련 비교 그룹 및 최적화 및 항체 특이성의 검증의 선택입니다. 분류 대상에서 대상 그룹 간의 차이점 histograms 및 세포 영상을 통해 예가 될 것입니다. 관련 수용체 및 신호 전달 경로의 변화에​​ 대한 철저한 분석과 결합된 이러한 데이터는 전문적인 동료에 면역 dysregulation을 기초 메커니즘에 귀중한 통찰력을 제공할 것입니다. 기술?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque 플러스 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> R848 </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-r848 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (16 %) </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td></tr><tr><td> BD는 파마 / 쉐이브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 554,723 </td></tr><tr><td> CD14-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-0149-41 </td></tr><tr><td> CD4-PacBlue </td><td> BD Pharmingen </td><td> 68,436 </td></tr><tr><td> 리니지 칵테일 1 (린 1)-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340,546 </td></tr><tr><td> CD11c-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 347,637 </td></tr><tr><td> CD123-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340,545 </td></tr><tr><td> 토끼 반 NF-κB (p65) </td><td> SantaCruz </td><td> SC-372 </td></tr><tr><td> Alexa647 F (AB &#39;) 2 염소 항 토끼 IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A21246 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약 및 장비. <table border="1"><tbody><tr><td> 셀 유형 </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> 알렉사 647 </td><td> PacBlue </td></tr><tr><td> 단핵구 </td><td></td><td> CD14 </td><td> NF-κB (p65) </td><td></td></tr><tr><td> MDC </td><td> Lin1 </td><td> CD11c </td><td> NF-κB (p65) </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> PDC </td><td> Lin1</td><td> CD123 </td><td> NF-κB (p65) </td><td> CD4 </td></tr></tbody></table> 신호 경로의 세포 계보 (Lineage) 염색법에 대한 표 2. 항체 패널 단핵구 : CD14 + MDC : Lin1-, CD4dim, CD11c + PDC : Lin1-, CD4dim, CD123 + Lin1 (혈통) 마커가 인 경우에는 3 번 CD, CD14, CD19, CD20, monocytes, NK 세포, T &amp; B 세포에 대한 CD56 마커를 포함합니다.

quantitative imaging of lineage-specific toll-like receptor-mediated signaling in monocytes and dendritic cells from small samples of human blood

면역 상태에서 개별 유사 감염에 반응을 파악하고 질병의 심각도 및 결과에 기여. 고령화는 바이러스성 및 세균성 감염으로 증가 자화율와 연관된와 체액에 잘 문서화된 감소뿐만 아니라 세포 매개 면역 반응의 1,2와 백신에 반응을 감소합니다. 우리는 최근에 수신자와 같은 수용체 (TLRs), 미생물 감염 및 트리거 항균 호스트 방어 반응 3 감지 타고난 면역 시스템의 주요 구성 요소에 노화의 영향을 평가했습니다. 건강한 인간 기증자의 큰 일대에서, 우리는 노인에서 해당 말초 혈액 monocytes 표현 및 특정 TLRs 4와 돌기 세포에서 유사한 감소 TLR 수준 및 신호 응답 (DC가)의 기능을 감소 보여줬에 필수적입니다 세포를 항원 제시 타고난 및 적응 면역 5 사이의 결합. 우리는 macrophages에 TLR3의 dysregulation을 보였습니다웨스트 나일 바이러스 6,7와 감염에 대한 반응으로 노인 기증자로부터 DC가에 의한 IFN의 D 낮은 생산. immunosenescence 우리의 이해와 치료 개입 파라마운트 응답 특정 세포 유형에 대한 자세한 이해와 신호 전달의 메커니즘 (들)입니다. FACS 또는 immunoblot에 의해 일차 전지 및 측량 세포 마커 영상을 통해 면역 반응의 전통적인 연구 결과 그러나 이러한 연구는 일반적으로 환자에서 제공하는 작은 샘플 볼륨과 여러에 복잡한 실험실 기술을 수행하는 무능력에 의해 기술적으로 제한되며, 크게 우리의 이해를 전진했습니다 인간의 샘플. ImageStream 동시 고해상도 디지털 영상과 양적 유동세포계측법을 결합하기 때문에 환자 자화율의 효율적인 캡처를위한 contemporaneously 여러 세포 인구의 조사를 용이하게합니다. 여기에서 DC가 ImageStream의 사용을 평가하기 위해 입증 TLR7 / 8인산화 및 면역 반응 8에 대한 중요한 여러 유전자의 전사를 시작하는 주요 전사 인자, NF-κB의 핵 translocation의 활성화 - 중재 증가합니다. 우리는 또한 최근 TLR5 신호와 9 노화에 변경된 면역 반응에 기여할 수 오래된 기증자로부터 monocytes에서 NF-κB 경로의 이전에 인식되지 않는 변경을 보여,이 기술을 사용했습니다.

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Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

우리는 (ImageStream 기술의 사용을 설명<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"&gt; www.amnis.com</a&gt;), 당신이 잘 정의된 환자의 동료에서 일차 면역 세포의 세포 메커니즘을 계량하기 위해, 동시 고해상도 디지털 영상과 함께 양적 유동세포계측법을 자랑합니다. 우리의 연구 주제 무리에서 소형 시료의 혈통 특정 세포 반응을 계량하기위한 translational 수사 청사진을 제공합니다.

Monocytes과 인간 혈액의 작은 샘플에서 돌기 세포의 리니지 특정 수신자 같은 수용체 - 매개 시그널링의 정량 이미징

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

수신자 같은 수용체 활성화 레굴라팅에 Neu1 Sialidase 활동 감지

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상<em&gt;를했다. 투스</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...