Name: chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue at JoVE.com

De auteurs willen graag Dr Keji Zhao&#39;s lab (NIH / NHLBI) bedanken voor hun hulp bij het verstrekken van sequencing resultaten. Wij zouden ook graag de UCSC genome project bedanken voor het gebruik van Genome Browser om in kaart gebracht sequencing leest te visualiseren. Dit werk werd ondersteund door de R00HD055052 NIH Pathway to Independence Award en R01HD065816 van NICHD, de Lucile Parkard Foundation en de Johns Hopkins University start-up financiering voor XC

(De hele chip procedure duurt ongeveer twee dagen. Voorbereiding van ChIP bibliotheken voor high-throughput sequencing duurt nog eens 2-3 dagen.) 1. Ontleden en Bereid weefsel voor ChIP Experiment (~ 1 miljoen cellen) <ol><li> Ontleden weefsel van belang (bijvoorbeeld 200 paar van Drosophila testes) in koude PBS + 1x proteaseremmer (los 1 pellet van protease inhibitor cocktail in 1,5 ml 1x PBS om 7x voorraad oplossing te verkrijgen) + PMSF (uiteindelijke concentra...

<ol>
	<li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster.">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li><li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells.">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li><li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li><li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage.">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li><li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis.">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li><li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles:+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis.">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li><li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis.">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li><li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq.">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li></ol>

De veelzijdigheid van ChIP analyses die in dit protocol kan worden gebruikt op verschillende weefsels, die een kans om de chromatine staat te studeren in een biologisch relevante systeem biedt. ChIP experimenten met gekweekte cellen systemen geschikt uitvoeren omdat grote hoeveelheden cellen kunnen gemakkelijk worden verkregen. Echter, gekweekte cellen niet noodzakelijk cellen in een meercellige omgeving. Door het ontwikkelen van deze techniek met behulp van ontleed weefsel van levende dieren, kunnen we in op vele vrage...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Compleet Mini proteaseremmer cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyde (37%) </td><td> Supelco </td><td> 47083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes pellet stamper </td><td> Fischer Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Lineaire polyacrylamide </td><td> Sigma </td><td> 56575-1 ml </td><td></td></tr><tr><td> Glycogeen </td><td> Qiagen </td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR groen / ROX qPCR Master Mix </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> Mini plaat spinner </td><td> LABNET </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> Real-time PCR-systeem </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td> Kleine Volume Ultrasone Processor </td><td> Misonix </td><td> HS-Excel 2000 </td><td> Model gestaakt </td></tr><tr><td> Dynabeads, Proteïne A </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> Dynamag magneet </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> Fenol: Chlorofrom: IAA </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentre DNA END-Repair Kit </td><td> Epicentre Biotechnologie </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Reaction Cleanup Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow fragment (3 &#39;→ 5&#39; exo-) </td><td> New England Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA ligase </td><td> Promega Corporation </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> Adapter oligonucleotiden </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Gekoppelde-End Primer 1.0 en 2.0 </td><td> Illumina </td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-Gel Electorphoresis systeem </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue

Epigenetica blijft een zich snel ontwikkelende veld dat bestudeert hoe de chromatine staat bijdraagt ​​aan de differentiële genexpressie in verschillende celtypen in verschillende ontwikkelingsstadia. Epigenetische regelgeving draagt ​​bij aan een breed spectrum van biologische processen, met inbegrip van cellulaire differentiatie tijdens de embryonale ontwikkeling en homeostase in de volwassenheid. Een kritische strategie in epigenetische studies is om te onderzoeken hoe verschillende histon modificaties en chromatine factoren genexpressie reguleren. Om dit aan te pakken, wordt chromatine immunoprecipitatie (ChIP) veel gebruikt om een ​​momentopname van de vereniging van specifieke factoren met DNA in de cellen van belang te verkrijgen. ChIP techniek maakt gebruik gewoonlijk gekweekte cellen als uitgangsmateriaal, dat kan worden verkregen in overvloed en homogeniteit reproduceerbaar te genereren. Er zijn echter verschillende nadelen: eerst het milieu cellen groeien in petrischaal verschilt van die in vivo, kan dusgeen afspiegeling van de endogene chromatine toestand van de cellen in een levend organisme. Ten tweede kunnen niet alle soorten van cellen gekweekt ex vivo. Er is slechts een beperkt aantal cellijnen, waarvan mensen genoeg materiaal ChIP assay verkrijgen. Hier beschrijven we een methode om ChIP experiment met behulp van Drosophila weefsels te doen. Het uitgangsmateriaal wordt ontleed weefsel van een levend dier kan dus nauwkeurig de endogene chromatine weerspiegelen. Het aanpassingsvermogen van deze methode met veel verschillende soorten weefsels kunnen de onderzoekers om veel meer biologisch relevante vragen met betrekking tot epigenetische regulatie in vivo 1, 2 aan te pakken. De combinatie van deze methode met high-throughput sequencing (ChIP-volgende) zal verder kunnen de onderzoekers om een ​​epigenomisch landschap te verkrijgen.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Onlangs high-throughput sequencing technologie is sterk toegenomen gevoeligheid van chromatine immunoprecipitatie (ChIP) experiment en gevraagd de toepassing ervan met behulp van gezuiverde cellen of weefsel ontleed. Hier hebben we een methode om af te bakenen ChIP techniek te gebruiken met<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsel waarin de endogene chromatine toestand in een goed gekarakteriseerd biologisch systeem te pakken.

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van Drosophila Weefsel

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Patroonvorming van embryonale stamcellen Met behulp van de Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Methylated DNA Immunoprecipitation

Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) om Assay Dynamic histon-eiwitten in Actieve genexpressie in menselijke cellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo&#39;s

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Kwantitatieve vergelijking van Cis-Regulatory Element (CRE) Activiteiten in transgene Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...