Name: chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue at JoVE.com

Die Autoren danken Herrn Dr. Keji Zhaos Labor (NIH / NHLBI) für ihre Hilfe bei der Bereitstellung von Sequenzierung Ergebnisse danken. Wir möchten auch, um die UCSC Genom-Projekt für die Nutzung der Genom-Browser zu visualisieren abgebildet Sequenzierung liest danken. Diese Arbeit wurde durch die NIH R00HD055052 Pathway worden zu Independence Award und R01HD065816 aus NICHD, der Lucile Parkard-Stiftung, und der Johns Hopkins University Anschubfinanzierung zu XC unterstützt

(Der gesamte Chip Prozedur dauert etwa zwei Tage. Vorbereitung der ChIP-Bibliotheken für Hochdurchsatz-Sequenzierung dauert weitere 2-3 Tage.) 1. Bereiten Sie sezieren und Tissue für Chip-Technologie (~ 1 Mio. Zellen) <ol><li> Sezieren Gewebe von Interesse (zB 200 Paare von Drosophila Hoden) in kaltem PBS + 1x Protease-Inhibitor (auflösen 1 Kugel von Protease-Inhibitor-Cocktail in 1,5 ml 1x PBS zu 7x Stammlösung zu erhalten) + PMSF (Endkonzentration 100 pg / m...

<ol>
	<li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster.">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li><li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells.">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li><li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li><li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage.">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li><li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis.">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li><li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles:+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis.">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li><li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis.">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li><li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq.">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li></ol>

Die Vielseitigkeit der Chip-Analysen in diesem Protokoll behandelt werden, können auf verschiedenen Geweben, die eine Gelegenheit, die Chromatin-Zustand in einer biologisch relevanten System zu studieren bietet eingesetzt werden. Chip-Experimenten unter Verwendung von Zellen aus kultivierten Systeme sind bequem durchgeführt werden, da große Menge von Zellen leicht erhalten werden kann. Jedoch nicht kultivierten Zellen nicht notwendigerweise Zellen in einem mehrzelligen Umgebung. Durch die Entwicklung dieser Technik m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Kompletter Mini Protease Inhibitor Cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyd (37%) </td><td> Supelco </td><td> 47.083 U- </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pistill </td><td> Fischer Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Linearem Polyacrylamid </td><td> Sigma </td><td> 56575-1ML </td><td></td></tr><tr><td> Glykogen </td><td> Qiagen </td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green / ROX qPCR Master Mix </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> Mini Plate Spinner </td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> Real-time PCR-System </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td> Small Volume Ultraschall-Prozessor </td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td> Modell eingestellt </td></tr><tr><td> Dynabeads, Protein A </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> Dynamag Magnet </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> Phenol: Chlorofrom: IAA </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentre DNA-END-Reparatur-Kit </td><td> Epicentre Biotechnologies </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Reaction Reinigungs Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow-Fragment (3 &#39;→ 5&#39; Exo-) </td><td> New England Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA-Ligase </td><td> Promega Corporation </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> Adaptor-Oligonukleotiden </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Gepaart-Ende-Primer 1,0 und 2,0 </td><td> Illumina </td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-Gel Elektrophorese-System </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue

Epigenetik bleibt ein sich schnell entwickelndes Feld, das untersucht, wie das Chromatin Zustand zu differentiellen Genexpression in verschiedenen Zelltypen in verschiedenen Entwicklungsstadien beiträgt. Epigenetische Regulation trägt zu einem breiten Spektrum an biologischen Prozessen wie Zelldifferenzierung während der Embryonalentwicklung und Homöostase im Erwachsenenalter. Eine kritische Strategie in der epigenetischen Studien ist zu untersuchen, wie verschiedene Histon-Modifikationen und Chromatin Faktoren Genexpression zu regulieren. Um dieses Problem anzugehen, wird Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) weit verbreitet, um einen Schnappschuss des Vereins von besonderer Faktoren, die mit DNA in den Zellen von Interesse zu erhalten verwendet. Chip-Technik häufig verwendet kultivierten Zellen als Ausgangsmaterial, das in Hülle und Fülle und Homogenität erhalten werden können, um reproduzierbare Daten zu generieren. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen: Erstens ist die Umgebung, um Zellen in Petri-Schale wachsen anders als in vivo, kann somitspiegeln nicht die endogenen Chromatin Zustand der Zellen in einem lebenden Organismus. Zweitens kann nicht alle Arten von Zellen ex vivo kultiviert werden. Es gibt nur eine begrenzte Anzahl von Zelllinien, von denen die Menschen genügend Material für die Chip-Assay erhalten können. Hier beschreiben wir eine Methode, um ChIP Experiment mit Drosophila Gewebe zu tun. Das Ausgangsmaterial wird Gewebe aus dem lebenden Tier seziert, so kann genau die endogenen Chromatin Zustand. Die Anpassungsfähigkeit dieser Methode mit vielen verschiedenen Arten von Gewebe ermöglicht es Forschern, viel mehr biologisch relevanten Fragen rund um epigenetische Regulation in vivo 1, 2 anzugehen. Die Kombination dieser Methode mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird weiter Forschern erlauben, eine epigenomischen Landschaft zu erhalten.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Kürzlich Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie hat stark Empfindlichkeit von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Experiment erhöht und aufgefordert ihre Anwendung unter Verwendung von gereinigten Zellen oder Gewebe präpariert. Hier haben wir beschreiben eine Methode zur Chip-Technik mit nutzen<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe, das den endogenen Chromatin Zustand in einem gut charakterisierten biologischen System adressieren kann.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Strukturierung von embryonalen Stammzellen mit dem Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Forschung

Biologie

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Methylated DNA Immunoprecipitation

Methylierte DNA Immunpräzipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...