Name: chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer ao laboratório do Dr. Keji Zhao (NIH / NHLBI) por sua ajuda no fornecimento de resultados de sequenciamento. Gostaríamos também de agradecer ao projeto genoma UCSC para o uso do navegador para visualizar o seqüenciamento do genoma mapeado lê. Este trabalho foi apoiado pela Pathway NIH R00HD055052 para Prêmio Independência e R01HD065816 do NICHD, a Lucile Parkard Foundation, ea Johns Hopkins University start-up financiamento para XC

(O procedimento todo leva ChIP aproximadamente dois dias. Preparação de bibliotecas de Fichas para high-throughput seqüenciamento leva mais de 2-3 dias). 1. Dissecar e preparação de tecidos para o Experimento chip (~ 1 milhão de células) <ol><li> Dissecar tecido de interesse (por exemplo, 200 pares de Drosophila testículos) em PBS frio inibidor da protease + 1x (dissolver 1 pelete de protease cocktail inibidor em 1,5 mL de PBS 1x para se obter solução de...

<ol>
	<li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster.">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li><li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells.">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li><li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li><li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage.">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li><li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis.">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li><li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles:+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis.">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li><li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis.">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li><li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq.">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li></ol>

A versatilidade do análises ChIP discutidos nesta protocolo pode ser utilizado em diferentes tecidos, o que proporciona uma oportunidade para estudar o estado de cromatina em um sistema biologicamente relevantes. Experimentos chip usando células a partir de sistemas de cultura são convenientes para realizar porque a grande quantidade de células pode ser facilmente obtida. No entanto, células de cultura não reflectem necessariamente células em um ambiente multi-celular. Ao desenvolver esta técnica usando tecido d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Coquetel inibidor de protease Mini completo </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> O formaldeído (37%) </td><td> Supelco </td><td> 47.083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes pellet pilão </td><td> Fischer Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> O kit de purificação PCR </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> De poliacrilamida linear </td><td> Sigma </td><td> 56575-1ml </td><td></td></tr><tr><td> Glicogênio </td><td> Qiagen </td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR green / ROX qPCR Mix Master </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> Mini placa giratório </td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> PCR em tempo real do sistema </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td> Processador de Pequeno Volume Ultrasonic </td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td> Modelo descontinuado </td></tr><tr><td> Dynabeads proteína, uma </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> Dynamag ímã </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> Fenol: Chlorofrom: IAA </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentro DNA END Repair Kit </td><td> Biotecnologias Epicentre </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute reaction Kit de limpeza </td><td> Qiagen </td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow Fragmento (3 &#39;→ 5&#39; exo-) </td><td> New England Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> DNA-ligase de T4 </td><td> Promega Corporation </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> Oligonucleotídeos Adaptor </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Emparelhado Fim-Primer 1,0 e 2,0 </td><td> Illumina </td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-Gel sistema Electorphoresis </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue

Epigenética continua a ser um campo de rápido desenvolvimento que estuda como o estado de cromatina contribui para a expressão diferencial de genes em tipos celulares distintos em diferentes estágios de desenvolvimento. Regulação epigenética contribui para um amplo espectro de processos biológicos, incluindo a diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário e homeostase na idade adulta. Uma estratégia fundamental em estudos epigenéticos é examinar como várias modificações de histonas e fatores de cromatina regular a expressão gênica. Para resolver isso, cromatina imunoprecipitação (CHIP) é amplamente utilizado para obter um instantâneo da associação de fatores particulares com DNA nas células de interesse. Técnica ChIP geralmente usa células cultivadas como material de partida, que pode ser obtido em abundância e homogeneidade para gerar dados reprodutíveis. No entanto, existem várias advertências: Primeiro, o ambiente para crescer as células em placa de Petri é diferente do que in vivo, assim, podenão reflectem o estado da cromatina endógena de células de um organismo vivo. Em segundo lugar, nem todos os tipos de células podem ser cultivadas ex vivo. Há apenas um número limitado de linhas de células, a partir do qual as pessoas podem obter material suficiente para ensaio ChIP. Aqui nós descrevemos um método para fazer experiência chip usando tecidos de Drosophila. O material de partida é dissecado de tecido de um animal vivo, assim com precisão pode reflectir o estado da cromatina endógena. A adaptabilidade deste método com muitos tipos diferentes de tecido irá permitir aos pesquisadores abordar muito mais perguntas biologicamente relevantes sobre regulação epigenética in vivo 1, 2. Combinando este método com alto rendimento de seqüenciamento (CHIP seq-) continuará a permitir que os investigadores de obter uma paisagem epigenômico.

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recentemente high-throughput tecnologia de seqüenciamento aumentou muito a sensibilidade da cromatina imunoprecipitação (CHIP) experiência e levou o seu aplicativo usando células purificadas ou tecido dissecado. Aqui nós delinear um método para usar a técnica de chip com<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecido, que pode tratar o estado da cromatina endógeno em um sistema bem caracterizada biológica.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP), utilizando Drosophila Tecido

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

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