Name: chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Keji Zhao labb (NIH / NHLBI) för deras hjälp att ge sekvensering resultat. Vi vill också tacka UCSC Genome Project för användning av Genome Browser för att visualisera kartlagt sekvensering läser. Detta arbete har fått stöd av R00HD055052 NIH vägen till Independence Award och R01HD065816 från NICHD den Lucile Parkard Foundation och Johns Hopkins University startbidrag till XC

(Hela ChIP Proceduren tar cirka två dagar. Beredning av chip bibliotek för high-throughput sekvensering tar ytterligare 2-3 dagar.) 1. Dissekera och förbereda Mjukpapper för ChIP Experiment (ca 1 miljon celler) <ol><li> Dissekera vävnad av intresse (t.ex. 200 par av Drosophila testiklar) i kall PBS + 1x proteashämmare (lös upp 1 pellet av proteashämmare cocktail i 1,5 ml 1 x PBS för att erhålla 7x stamlösning) + PMSF (slutlig koncentration 100 pg / ml)....

<ol>
	<li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster.">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li><li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells.">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li><li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li><li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage.">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li><li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis.">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li><li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles:+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis.">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li><li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis.">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li><li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq.">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li></ol>

Mångsidigheten av chip analyser som diskuteras i detta protokoll kan användas på olika vävnader, vilket ger en möjlighet att studera kromatinet staten i ett biologiskt relevant system. CHIP experiment med användning av celler från odlade system är bekvämt att utföra eftersom stora mängder av celler kan lätt erhållas. Däremot odlade celler inte nödvändigtvis celler i en multi-cellulär miljö. Genom att utveckla denna teknik använder dissekeras vävnad från levande djur, kan vi ta itu med många frågor...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Komplett Mini proteasinhibitorcocktail </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyd (37%) </td><td> Supelco </td><td> 47.083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 78.830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes pellet mortelstöt </td><td> Fischer Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28.104 </td><td></td></tr><tr><td> Linjär polyakrylamid </td><td> Sigma </td><td> 56.575-1 ml </td><td></td></tr><tr><td> Glykogen </td><td> Qiagen </td><td> 158.930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR grön / ROX qPCR Master Mix </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> Mini plattan spinnaren </td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> Real time PCR-system </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td> Liten volym Ultrasonic Processor </td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td> Modell avbrytas </td></tr><tr><td> Dynabeads, protein A </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> Dynamag magneten </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> Fenol: kloroform: IAA </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentrum DNA END-Repair Kit </td><td> Epicentrum Bioteknik </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Reaction Cleanup kit </td><td> Qiagen </td><td> 28.204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow-fragment (3 &#39;→ 5&#39; exo-) </td><td> New England Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA-ligas </td><td> Promega Corporation </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> Adaptor oligonukleotider </td><td> Belysning </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Kopplade-End Primer 1,0 och 2,0 </td><td> Belysning </td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-Gel Electorphoresis systemet </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue

Epigenetik är en snabbt växande fält som studerar hur kromatin staten bidrar till differentiell genuttryck i olika celltyper i olika utvecklingsstadier. Epigenetisk reglering bidrar till ett brett spektrum av biologiska processer, inbegripet cellplattor differentiering under fosterutvecklingen homeostas i vuxen ålder. En kritisk strategi i epigenetiska studier är att undersöka hur olika histon modifikationer och kromatin faktorer reglerar genuttryck. För att lösa detta är Chromatin Immunoprecipitation (chip) används allmänt för att få en ögonblicksbild av föreningen av särskilda faktorer som DNA i cellerna av intresse. ChIP teknik använder vanligen odlade celler som utgångsmaterial, vilka kan erhållas i överflöd och homogenitet för att generera reproducerbara data. Det finns emellertid flera förbehåll: För det första är den miljö att växa celler i Petri-skål som skiljer sig från in vivo, vilket kaninte återspeglar den endogena kromatinet tillståndet av celler i en levande organism. För det andra kan inte alla typer av celler vara odlade ex vivo. Det finns bara ett begränsat antal cellinjer, från vilken människor kan få tillräckligt med material för ChIP analys. Här beskriver vi en metod för att göra ChIP experiment med Drosophila vävnader. Utgångsmaterialet dissekeras vävnad från ett levande djur, vilket exakt kan reflektera den endogena kromatin staten. Anpassningsförmåga denna metod med många olika typer av vävnad kommer att tillåta forskare att ta itu med en mycket mer biologiskt relevanta frågor om epigenetisk reglering in vivo 1, 2. Genom att kombinera denna metod med hög genomströmning sekvensering (chip-punkter) kommer ytterligare att låta forskare för att få en epigenomiska landskap.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Nyligen high-throughput sekvensering teknik har ökat kraftigt känslighet Chromatin Immunoprecipitation (chip) experiment och till grund för dess tillämpning med renade celler eller dissekeras vävnad. Här har vi avgränsa en metod att använda ChIP teknik med<em&gt; Drosophila</em&gt; Vävnad, som kan klara den endogena kromatinet tillstånd i en väldefinierad biologiskt system.

Kromatin Immunoutfällning (chip) med användning av Drosophila Vävnad

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Mönstring av embryonala stamceller med hjälp av Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

En kromatin-analys för mänskliga hjärnvävnaden

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Kromatin Immunoprecipitation från mänskliga embryonala stamcellslinjer

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Methylated DNA Immunoprecipitation

Metylerat DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Kromatin Immunoprecipitation (chip) för analys Dynamisk Histon Ändring i aktiverade genuttryck i humana celler

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Kromatin Immunoprecipitation analys för Tissue-specifika gener med början av karriären musembryon

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Kvantitativ jämförelse av Cis-Regulatory Element (CRE) Aktiviteter i transgena Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Effektiv Kromatin Immunoprecipitation med begränsande mängder av biomassa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Av hög kvalitet om Kromatin Immunoprecipitation DNA Mall för hög genomströmning sekvensering (chip-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Den ChroP Approach Kombinerar Chip och masspektrometri att dissekera Locus-specifika Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...