Name: lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching at JoVE.co

אנו אסירי תודה על האמון Wellcome ו ERC עבור תמיכה כספית. IMGG הוא עמית EMBO. KLH הוא סטודנט BBSRC במימון PhD. אנו מודים פיליפ רובין ופטריק Tidball לתמיכה בתרבות טכנית תא וד&quot;ר אנדרו דוהרטי לצורך תחזוקה וסיוע מיקרוסקופים את.

<ol>
	<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It's+green+outside:+tracking+cell+surface+proteins+with+pH-sensitive+GFP.">It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP.</a> Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).</li><li>Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+recovery+and+anisotropy+decay+of+green+fluorescent+protein+GFP-S65T+in+solution+and+cells:+cytoplasmic+viscosity+probed+by+green+fluorescent+protein+translational+and+rotational+diffusion.">Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion.</a> Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li><li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li><li>Ashby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+AMPA+receptors+(AMPARs)+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs.">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).</li><li>Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-activity-modifying+proteins+are+required+for+forward+trafficking+of+the+calcium-sensing+receptor+to+the+plasma+membrane.">Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).</li><li>Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+drives+constitutive+exchange+of+AMPA+receptors+at+dendritic+spines+and+is+regulated+by+spine+morphology.">Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology.</a> J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).</li><li>Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+kainate+receptor+surface+expression+in+hippocampal+neurons.">Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons.</a> J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+membrane+drift+recruits+AMPA+receptors+to+dendritic+spines.">Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines.</a> J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

אנו מתארים אסטרטגיה חדשנית לחזות את מרכיבי סחר חלבון פלזמה הממברנה. גישה קומבינטורית של photobleaching טכניקות עם חלבון ספטמבר, מתויג מאפשרת סלקטיבי הכניסה פלזמה אירועים קרום להיות מוערך. לפי הרף photobleaching את החלבונים בממברנה של איגוף אזורים במהלך ההתאוששות, שיטת &quot;FRAP כפכפי&quot; מעריך את התרומה של סחר שלפוחי להחלמה פלואורסצנטי. זו גישה חדשנית מאפשרת הקלטה ישירה של החדרת חלבון ממברנה, המאפשרת גם את מספר תת תאים שבהם ההתאוששות הוא ציין לבין המשרעת של התאוששות (ΔF) במצב יציב שייקבע. יתר על כן, השוואה של FRAP עם ובלי פליפ מאפשר שיעור ההחלמה המיוחס דיפוזיה לרוחב להיות מחושב. יתר על כן, בניסוי עם זאת, אזורים של דנדריט לא photobleached בסמוך לאזורים photobleached משני צדי יכול להיותהערכה איכותית במהלך ההתאוששות, אובדן פלואורסצנציה נצפו באזורים אלה יהיו בשל פיזור רוחבי של קולטנים photobleached אל אלה שאינם photobleached חלקי דנדריט. פרוטוקול זה photobleaching סלקטיבי יכול להיות מנוצל כדי לבחון מגוון של תהליכי הסחר תאיים כגון אפיון excocytosis בקרום פלזמה ב subareas מוגדרים (למשל, דנדריטים או עמוד שדרה) או FRAP בהערכת התרומה של הכניסה דיפוזיה לרוחב לעומת ידי ביצוע FRAP במקביל ו &#39; כפכפי &#39;פרוטוקולים לאורך דנדריטים סמוכים (איור 3). ברור, בעוד הנחיות ספציפיות הוצגו, במעבדה כל אחד צריך לייעל את הפרמטרים הדמיה על פי דגימות וציוד ספציפיים. חשוב לציין, כל הקולטנים על פני השטח של ההחזר על ההשקעה צריך להיות photobleached, עצמאית של המטוס Z-ציר מרכזי, אך ללא נזק משמעותי phototoxic או לא ספציפית photobleaching. לנוERS יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ניסיון בפרוטוקול זה ב סומה את התא, כמו אחוז גבוה של תאים pH נמוך יחסית תאיים בדרך כלל התוצאות רקע הקרינה גבוהה באזורים אלו. יתר על כן, בעוד אנו הוכיחו עד כמה טכניקה זו ניתן ליישם משתנה דרכים, לפני תחילת הניסויים photobleaching סלקטיבי חדש ספטמבר, מתויג לבנות, אנו ממליצים כי האפיון הראשוני של קולטני מתוייגים מתנהל 1, כפי שתואר על ידי אשבי ואח&#39; 2. באופן כללי, שיטה זו היא עיבוד רב עוצמה ורב לפרוטוקול FRAP סטנדרטי, המאפשר אירועים הכניסה קרום הפלזמה לעבור הערכה בזמן אמת הקרוב.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; שם מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; החברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוגי</strong</td&gt;<td<strong&gt; תגובות (לא חובה)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; זכוכית coverslips 24mm</td&gt;<td&gt; VWR הבינלאומי</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פולי-L-ליזין</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td&gt; 1mg/ml במאגר borate כדי coverslips מעיל</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal בינוני</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2% בציפוי העצבית והאכלה בינוני</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פניצילין סטרפטומיצין</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1% בציפוי העצבית והאכלה בינוני</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-גלוטמין</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<td&gt; 2 מ&quot;מ / 0.8mM בציפוי / האכלה בינוני</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סוסים סרום</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; 10% בתקשורת ציפוי נוירונים בלבד</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 שיבוט וקטור</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; לייצור וירוס Sindbis</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 confocal מערכת META</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; תמונה J תוכנה</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; גישה פתוחה התוכנה. את כל התוספים המתוארות כאן זמינים<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching

<p class="jove_content"&gt; חלבונים ממברנה כגון קולטנים ותעלות יונים עוברים סחר פעיל נוירונים, אשר מקוטב מאוד מורכבת מורפולוגית. זה סחר בבני מכוונת היא בעלת חשיבות ראשונה במעלה לספק, לשמור או להסיר חלבונים סינפטיים.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; סופר האקליפטית pHluorin (ספטמבר) היא נגזרת של ה-pH רגיש eGFP, שבו נעשה שימוש נרחב הדמיה תא חי של חלבונים פלזמה הממברנה<sup&gt; 1-2</sup&gt;. ב-pH נמוך, protonation של ספטמבר מקטין קליטת פוטון ומונע פליטת הקרינה. כאירועים הסחר תאיים ביותר מתרחשים תאים עם pH נמוך, שבו ספטמבר הקרינה היא האפילה, את האות הקרינה מן בספט &#39;מתוייגים החלבונים הוא בעיקר מן הקרום פלזמה שבו ספטמבר חשוף לסביבה pH נייטרלי תאיים. כאשר האיר על ספטמבר בעוצמה גבוהה, כמו כל צבע פלואורסצנטי, הוא photodamaged באופן בלתי הפיך (photobleached)<sup&gt; 3-5</sup&gt;. חשוב לציין, כי ה-pH נמוך מרווה את קליטת פוטון, רק פני השטח לידי ביטוי ספטמבר ניתן photobleached ואילו ספטמבר תאיים אינו מושפע תאורה בעוצמה גבוהה<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; FRAP (שחזור הקרינה לאחר photobleaching) של החלבונים המתויגים בספט &#39;היא טכניקה נוח ורב עוצמה להערכת הדינמיקה חלבון על קרום הפלזמה. כאשר החלבונים המתויגים fluorescently הם photobleached באזור של עניין (ROI) התאוששות הקרינה מתרחשת עקב תנועה של חלבונים ספטמבר, מתוייגים מולבן לאזור מולבן. זה יכול להתרחש באמצעות דיפוזיה לרוחב ו / או exocytosis הלא photobleached קולטנים מסופק אם על ידי<em&gt; דה נובו</em&gt; סינתזה או מיחזור (ראה איור. 1). חלק קטן של החלבון נייח ונייד ניתן לקבוע את הניידות קינטיקה של חלקיק diffusible יכול להיחקר בתנאי הבסיס, מגורה כגון יישום אגוניסט או גירויים עצביים כגון הפעלת NMDA או KCl יישום<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; אנחנו מתארים טכניקות photobleaching שנועדו סלקטיבי לדמיין את ההתאוששות של הקרינה המיוחס exocytosis. בקצרה, ההחזר על ההשקעה הוא photobleached פעם עם פרוטוקולים סטנדרטיים FRAP, ואחריו, אחרי התאוששות קצרה, חוזר על עצמו על ידי הלבנת האזורים משני צדי. פרוטוקול זה &quot;FRAP-פליפ&quot;, שפותחה במעבדה שלנו, נעשה שימוש כדי לאפיין סחר AMPA הקולטן על הקוצים הדנדריטים<sup&gt; 10</sup&gt;, והוא חל על מגוון רחב של מחקרים על מנת להעריך סחר סחר exocytosis תאיים ו.</p

Watch this Scientific Journal Video about Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching at JoVE.co

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

דו&quot;ח זה מתאר את השימוש הדמיה תא חי וטכניקות photobleach לקבוע את הבעת פני, מסלולי תחבורה קינטיקה סחר exogenously GFP-מתוייגים הביע pH רגיש, חלבונים על הממברנה של נוירונים.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) של החלבונים המתויגים הקרינה הקוצים הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

הקרינה ופליטת אור הדמיה של Ca subcellular<sup&gt; 2 +</sup&gt; בבני נוירונים בהיפוקמפוס

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...