Name: lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00
Duration: 11 min 58 s
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हम वेलकम ट्रस्ट और वित्तीय सहायता के लिए ईआरसी के लिए आभारी हैं. IMGG EMBO फैलो है. KLH बीबीएसआरसी वित्त पोषित पीएचडी छात्र है. हम तकनीकी और सेल संस्कृति और रखरखाव और सूक्ष्मदर्शी साथ सहायता के लिए समर्थन डॉ. एंड्रयू Doherty के लिए में फिलिप रुबिन और पैट्रिक Tidball धन्यवाद.

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	<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It's+green+outside:+tracking+cell+surface+proteins+with+pH-sensitive+GFP.">It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP.</a> Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).</li><li>Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+recovery+and+anisotropy+decay+of+green+fluorescent+protein+GFP-S65T+in+solution+and+cells:+cytoplasmic+viscosity+probed+by+green+fluorescent+protein+translational+and+rotational+diffusion.">Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion.</a> Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li><li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li><li>Ashby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+AMPA+receptors+(AMPARs)+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs.">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).</li><li>Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-activity-modifying+proteins+are+required+for+forward+trafficking+of+the+calcium-sensing+receptor+to+the+plasma+membrane.">Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).</li><li>Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+drives+constitutive+exchange+of+AMPA+receptors+at+dendritic+spines+and+is+regulated+by+spine+morphology.">Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology.</a> J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).</li><li>Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+kainate+receptor+surface+expression+in+hippocampal+neurons.">Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons.</a> J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+membrane+drift+recruits+AMPA+receptors+to+dendritic+spines.">Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines.</a> J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

हम एक अभिनव रणनीति के प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी के घटक कल्पना का वर्णन. सितम्बर टैग प्रोटीन के साथ तकनीक photobleaching की मिश्रित दृष्टिकोण चुनिंदा प्लाज्मा झिल्ली प्रविष्टि घटनाओं मूल्यांकन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है. लगातार वसूली के दौरान flanking क्षेत्रों में झिल्ली प्रोटीन photobleaching, &#39;FRAP फ्लिप&#39; विधि प्रतिदीप्ति वसूली vesicular तस्करी के योगदान का आकलन है. इस उपन्यास दृष्टिकोण प्रोटीन झिल्ली प्रविष्टि का प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, सक्षम दोनों उप डिब्बों की संख्या और जहां वसूली मनाया जाता है वसूली (ΔF) के आयाम स्थिर अवस्था में निर्धारित किया है. इसके अलावा, फ्लिप के साथ और बिना FRAP की तुलना वसूली के अनुपात पार्श्व प्रसार करने के लिए गणना की जा करने के लिए attributable की अनुमति देता है. इसके अलावा, एक ही प्रयोग में, गैर - photobleached dendrite flanking photobleached क्षेत्रों को निकट के क्षेत्रों में हो सकता हैगुणात्मक वसूली के दौरान मूल्यांकन, प्रतिदीप्ति इन क्षेत्रों में मनाया नुकसान dendrite की इन गैर photobleached के क्षेत्रों में photobleached रिसेप्टर्स की पार्श्व प्रसार के कारण हो जाएगा. इस चयनात्मक photobleaching प्रोटोकॉल के रूप में परिभाषित subareas में प्लाज्मा झिल्ली में excocytosis निस्र्पक (उदाहरण के लिए, dendrites या कांटा) या समानांतर FRAP द्वारा आयोजित पार्श्व प्रसार बनाम प्रविष्टि के योगदान का आकलन करने और FRAP सेलुलर तस्करी प्रक्रियाओं की एक किस्म की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है आसन्न dendrites के साथ &#39;फ्लिप प्रोटोकॉल (3 छवि). जाहिर है, जबकि विशिष्ट दिशा निर्देशों प्रस्तुत किया गया है, प्रत्येक प्रयोगशाला विशिष्ट नमूनों और उपकरणों के अनुसार इमेजिंग मापदंडों का अनुकूलन की आवश्यकता होगी. महत्वपूर्ण बात है, लागत पर लाभ में सभी सतह रिसेप्टर्स करने के लिए z-अक्ष फोकल हवाई जहाज़ की photobleached, स्वतंत्र है, लेकिन महत्वपूर्ण phototoxic क्षति या गैर विशिष्ट photobleaching के बिना होने की जरूरत है. हमेंनेताओं सावधानी बरतें जब सेल सोम पर अपेक्षाकृत कम पीएच intracellular डिब्बों आम तौर पर इन क्षेत्रों में उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में परिणाम के उच्च प्रतिशत के रूप में इस प्रोटोकॉल का प्रयास करना चाहिए,. इसके अलावा, whilst हम दिखा दिया है कि इस तकनीक में लागू किया जा सकता तरीके बदलता है पर चयनात्मक photobleaching प्रयोगों के शुरू करने से पहले, एक नई सितम्बर टैग निर्माण, हम सलाह है कि टैग रिसेप्टर्स की एक प्रारंभिक लक्षण वर्णन पहले आयोजित किया जाता है एश्बी एट अल द्वारा के रूप में वर्णित 2. कुल मिलाकर, इस विधि मानक FRAP प्रोटोकॉल का एक शक्तिशाली और बहुमुखी अनुकूलन है, सक्षम प्लाज्मा झिल्ली में सम्मिलन घटनाओं के पास वास्तविक समय में मूल्यांकन किया जाना है.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; अभिकर्मक का नाम</strong</td&gt;<td<strong&gt; कंपनी</strong</td&gt;<td<strong&gt; सूचीपत्र संख्या</strong</td&gt;<td<strong&gt; टिप्पणियां (वैकल्पिक)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24mm कांच coverslips</td&gt;<td&gt; VWR इंटरनेशनल</td&gt;<td631-0161&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; पाली एल Lysine</td&gt;<td&gt; सिग्मा</td&gt;<tdP2636&gt;</td&gt;<td&gt; Borate बफर में कोट coverslips को 1mg/ml</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal मध्यम</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td21,103&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdB27-&gt;</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td17504-044&gt;</td&gt;<td&gt; Neuronal चढ़ाना 2% और मध्यम खिला</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन</td&gt;<td&gt; सिग्मा</td&gt;<tdP0781&gt;</td&gt;<td&gt; Neuronal चढ़ाना 1% और खिला माध्यम</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; एल Glutamine -</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td25,030&gt;</td&gt;<td&gt; 2mm / 0.8mm चढ़ाना / खिला मध्यम में</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; हार्स सीरम</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; Neuronal चढ़ाना मीडिया में केवल 10%</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 क्लोनिंग वेक्टर</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<tdK75001&gt;</td&gt;<tdहै&gt; Sindbis वायरस के उत्पादन के लिए</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 मेटा confocal प्रणाली</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; छवि जम्मू सॉफ्टवेयर</td&gt;<td&gt; एनआईएच</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; खुले उपयोग सॉफ्टवेयर. यहाँ बताया प्लगिन उपलब्ध पर हैं<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

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Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

इस रिपोर्ट को जीवित कोशिका इमेजिंग और photobleach तकनीक का उपयोग करने के लिए सतह अभिव्यक्ति, परिवहन रास्ते और exogenously व्यक्त, पीएच के प्रति संवेदनशील GFP टैग न्यूरॉन्स के प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन की तस्करी कैनेटीक्स निर्धारित करने का वर्णन करता है.

के लेटरल और सभ्य न्यूरॉन्स में झिल्ली प्रोटीन का प्रसार exocytosis प्रतिदीप्ति रिकवरी और प्रतिदीप्ति नुकसान Photobleaching का उपयोग मूल्यांकन

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति रिकवरी (FRAP) संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines में प्रतिदीप्ति प्रोटीन के टैग की गईं

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

लाइव चूहा cortical न्यूरॉन्स में mitochondrial झिल्ली संभावित और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के निर्धारण

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

संवर्धित सीएनएस न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान रीढ़ आकृति विज्ञान के विश्लेषण

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

संवर्धित अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स एफएम रंगों का उपयोग करने में Synaptic पुटिका पूल पुनःपूर्ति के मात्रात्मक विश्लेषण

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

संवर्धित सहानुभूति न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान विकास उत्प्रेरण

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

इमेजिंग प्राथमिक संवर्धित माउस न्यूरॉन्स में प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर निवेशन pHluorin टैग

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

लाइव सभ्य न्यूरॉन्स के एंटीबॉडी खिलाने के बाद सेल सतह और भली भाँति प्रोटीन का अंतर लेबल

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

एक असंतत सुक्रोज ढाल का उपयोग Synaptic प्लाज्मा झिल्ली और postsynaptic घनत्व प्रोटीन की तैयारी

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Subcellular सीए की प्रतिदीप्ति और bioluminescence इमेजिंग<sup&gt; 2 +</sup&gt; वृद्ध hippocampal न्यूरॉन्स में

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग के संवर्धित न्यूरॉन्स में एंडोसोम और लियोसोम की क्षमताओं का मात्रा

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...