Name: lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching at JoVE.co

Мы благодарны Wellcome Trust и ERC за финансовую поддержку. ИМГиГ является членом EMBO. KLH является СИББН финансируемых аспирант. Мы благодарим Филиппа Рубин и Патрик Tidball технических и клеточной поддержки культуры и д-р Эндрю Доэрти на техническое обслуживание и помощь с микроскопами.

<ol>
	<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It's+green+outside:+tracking+cell+surface+proteins+with+pH-sensitive+GFP.">It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP.</a> Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).</li><li>Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+recovery+and+anisotropy+decay+of+green+fluorescent+protein+GFP-S65T+in+solution+and+cells:+cytoplasmic+viscosity+probed+by+green+fluorescent+protein+translational+and+rotational+diffusion.">Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion.</a> Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li><li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li><li>Ashby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+AMPA+receptors+(AMPARs)+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs.">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).</li><li>Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-activity-modifying+proteins+are+required+for+forward+trafficking+of+the+calcium-sensing+receptor+to+the+plasma+membrane.">Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).</li><li>Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+drives+constitutive+exchange+of+AMPA+receptors+at+dendritic+spines+and+is+regulated+by+spine+morphology.">Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology.</a> J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).</li><li>Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+kainate+receptor+surface+expression+in+hippocampal+neurons.">Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons.</a> J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+membrane+drift+recruits+AMPA+receptors+to+dendritic+spines.">Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines.</a> J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы описываем инновационной стратегии для визуализации компонентов плазмы торговли белковой оболочки. Комбинаторный подход фотообесцвечивания техники с SEP-меченый белок плазмы позволяет выборочно события мембраны вставки в оценке. Постоянно фотообесцвечивания мембранных белков в фланговые регионов во время восстановления, метод «FRAP-FLIP&quot; оценивает вклад везикулярного торговли людьми флуоресценции восстановления. Этот новый подход позволяет осуществлять прямую запись белка вставки мембраны, что позволяет как количество суб-купе, где наблюдается восстановление и амплитуда восстановления (ΔF) в устойчивое состояние не определено. Кроме того, сравнение FRAP и без FLIP позволяет доля восстановление связано с боковой диффузии рассчитывается. Кроме того, в одном эксперименте, регионы, не photobleached дендритов, прилегающих к фланговой photobleached регионах может бытькачественно оценить во время восстановления; флуоресценции потери наблюдаются в этих регионах будет происходить за счет боковой диффузии photobleached рецепторов в этих не photobleached сегменты дендритов. Такое избирательное фотообесцвечивания протокол может быть использован для исследования различных клеточных процессов, таких как торговля характеризующие excocytosis в мембране в определенной подобласти (например, дендриты или шипами) или оценке вклада боковой вставкой против диффузии путем проведения параллельного FRAP и «FRAP -FLIP &quot;протоколов по смежные дендритов (рис. 3). Очевидно, что в то время как конкретные рекомендации были представлены, каждая лаборатория необходимо оптимизировать параметры изображения в зависимости от конкретных образцов и оборудования. Важно отметить, что все поверхностные рецепторы в ROI должен быть photobleached, независимо от оси фокальной плоскости, но без существенного ущерба или фототоксических неспецифические фотообесцвечивания. НамERS следует проявлять осторожность при попытке этого протокола в клетке сомы, как высокий процент относительно низким рН внутриклеточных отсеков обычно приводит к флуоресценции фона в этих регионах. Кроме того, в то время как мы показали, как этот метод может быть применен в варьирует пути, до начала избирательный фотообесцвечивания эксперименты на новом SEP-меченый построить, мы советуем, что начальная характеристика помеченные рецепторов впервые проводились, как описано Эшби и др. 2. В целом, этот метод является мощным и универсальным адаптация стандартного протокола FRAP, что позволяет вставки событий в мембране должны быть оценены в режиме реального времени.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Название реагента</strong</td&gt;<td<strong&gt; О компании</strong</td&gt;<td<strong&gt; Номер по каталогу</strong</td&gt;<td<strong&gt; Комментарии (опционально)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24 мм покровные стекла</td&gt;<td&gt; VWR International</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Поли-L-лизин</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td&gt; 1mg/ml в боратном буфере, чтобы покрыть покровные</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal среднего</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21 103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2% нейронов покрытие и кормления средние</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Пенициллин стрептомицин</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1% нейронов покрытие и кормления средние</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-глютамин</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25 030</td&gt;<td&gt; 2 мм / 0,8 мм в посеве / кормления средних</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Лошадиной сыворотки</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; 10% нейронов в средствах массовой информации только покрытие</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 клонирования вектор</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Для производства вирусов Синдбис</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 META конфокальной системы</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Image J Software</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Программное обеспечение с открытым доступом. Все плагины, описанные здесь имеются в<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching

<p class="jove_content"&gt; Мембранные белки, такие как рецепторы и ионные каналы подвергаются активной торговли в нейронах, которые сильно поляризован и морфологически сложных. Это направлено торговли имеет принципиальное значение, чтобы поставить, сохранить или удалить синаптические белки.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Супер-эклиптики pHluorin (SEP) является рН-чувствительные производной EGFP, которые широко используются для живых клеток белков плазматической мембраны<sup&gt; 1-2</sup&gt;. При низких значениях рН, протонирования СЭП уменьшает поглощение фотона и устраняет флуоресценции. Как и большинство внутриклеточных событий торговли происходят в помещениях с низким рН, где сентября флуоресценции затмение сигнала флуоресценции от SEP-меченных белков, в основном, от плазматической мембраны, где ПСР подвергается нейтральном рН внеклеточной среды. При освещении на высоком сентября интенсивность, как и каждый флуоресцентный краситель, является необратимым фотоповрежденной (photobleached)<sup&gt; 3-5</sup&gt;. Важно отметить, что из-за низких рН утоляет поглощения фотонов, только поверхности, выраженное сентября можно photobleached в то время как внутриклеточные ПСР не зависит от высокой освещенности<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; FRAP (флуоресценция восстановления после фотообесцвечивания) из SEP-меченных белков является удобным и мощным средством для оценки динамики белков в мембране. Когда помеченный флуоресцентной белки photobleached в области интереса (ROI) восстановление флуоресценции происходит за счет движения небеленой SEP-меченных белков в беленой региона. Это может произойти через боковое распространение и / или экзоцитоз без photobleached рецепторов поставляется либо<em&gt; De Novo</em&gt; Синтеза или утилизации (см. рис. 1). Доля неподвижной и подвижной белка может быть определена и мобильности и кинетики диффундирующие фракция может быть допрошен в базальной и стимулированной условий, таких как применение агонистов или нейронов стимулы, такие как активация NMDA и применение KCl<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Мы описываем фотообесцвечивания методы предназначены для выборочной визуализации восстановления флуоресценции объясняется экзоцитоза. Короче говоря, ROI в photobleached раз как со стандартными протоколами FRAP, а затем, после непродолжительного восстановления, повторяющихся отбеливания фланговых районах. Этот протокол &quot;FRAP-FLIP, разработанных в нашей лаборатории, были использованы для характеристики АМРА торговли на дендритных шипиков<sup&gt; 10</sup&gt;, И распространяется на широкий круг торговли исследований для оценки внутриклеточного торговли и экзоцитоз.</p

Watch this Scientific Journal Video about Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching at JoVE.co

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

В настоящем докладе описывается использование живых клеток и photobleach методы определения поверхностной экспрессии, транспортные пути и торговли кинетики экзогенно выражается, рН-чувствительные GFP-меченных белков в мембране нейронов.

Боковая диффузия и экзоцитоз мембранных белков в культивируемых нейронов оценивали по флуоресценции и флуоресценции восстановления потерь фотообесцвечивания

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) флуоресценции меткой Белки в Дендритные Шипы культивированный нейронов гиппокампа

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Определение Митохондриальная мембранного потенциала и активных форм кислорода в Живом Крыса корковых нейронов

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Анализ морфологии Дендритные позвоночника в культуре нейронов ЦНС

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Количественный анализ Synaptic пополнение бассейна пузырьков в культуре нейронов мозжечка гранул использованием FM Красители

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Вовлечение рост дендритов в культуре симпатических нейронов

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

PHluorin изображений с метками рецепторов вставки в плазматическую мембрану в первичной культуре нейронов мыши

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Дифференциальный Маркировка клеточной поверхности и интернализированных белков после антитела Кормление Живая культивируемых нейронов

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Подготовка Synaptic плазматической мембраны и Постсинаптических белков плотности с использованием разрывной градиента сахарозы

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Флуоресценции и Биолюминесценция изображений субклеточных Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; У пожилых нейронов гиппокампа

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Количественная оценка подвижности эндосомы и лизосом в культивируемых нейронах с помощью флуоресцентных зондов

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...