Name: identification and characterization of protein glycosylation using specific endo- and exoglycosidases
Uploaded: 2011-12-26T13:00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases at JoVE.com

דון מסרק

<html> 1. אנזימתי deglycosylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צינורות PCR כדי להקטין את איבוד המים בשל התאדות. תווית אחת מערכת של צינורות 1-7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה חיץ G7 10X, 10X החיץ גליקופרוטאין denaturing, ושל 10% NP-40 ו לטפוח בעדינות את הצינורות כדי לערבב את תוכנו. שמור בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האנזים בקבוקונים המכילים על הקרח. נסו למזער את ההפשרה / ההקפאה מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את תכולת הבקבוקון hCGβ (150 מיקרוגרם) ב 600 μl של DH 2 O ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ל של חיץ 1X G7 על ידי דילול המניות 10X ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 0.5 μl של PNGase F במאגר μl 25 G7 1X ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת exoglycosidase (EG לערבב) על ידי שילוב של 2 μl כל α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1 Galactosidase-3, ו α1-3, 6 Galactosidase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת צינורות PCR כמצוין: </li></ol>AK &quot;&gt; <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Tube / מדגם # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> hCGβ (0.25mg/ml) </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> גליקופרוטאין 10X Denaturing הצפת </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td></tr></tbody></table><ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי הצינורות, מערבבים בעדינות ומניחיםthermocycler, לסגור את המכסה לפגל את החלבונים על ידי דוגרים 10 דקות 94 ° C, ואחריו להחזיק 4 מעלות צלזיוס (באמצעות צינורות PCR ב thermocycler מאוד ומונע אידוי בדגימות נפח קטן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורות מן thermocycler ו צנטריפוגות כדי להסיר כל התעבות גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ריאגנטים הבאים כמצוין: </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לדוגמה # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> מאגר ה-G7 10X </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5 &amp; mu; L </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> PNGase F 1:50 דיל. </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Deglycosylation Mix </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> לערבב EG </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 10μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> התגובה סך vol. </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l &lt;/ Td&gt; <td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td></tr></tbody></table><ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הצינורות באמצעות PCR כובעים חדשים (להשליך את אלה המשמשים מאז הם לא מתאימים כמו שצריך אחרי מחזור אחד הדגירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות את הצינורות על ידי הקשה 4 פעמים ואז לסובב את התוכן כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות thermocycler ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לאחר מכן לקרר את דגימות עד 4 ° C. </li></ol> 2. SDS-PAGE של דגימות deglycosylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 130 μl טרי חיץ 3X הפחתת SDS טוען ידי הוספת 4 μl של DTT 1.25M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12.5 μl של החיץ מוכן 3X SDS הפחתת העמסה לטעום כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הצינורות עם כובעים חדשים לטפוח בעדינות את הצינורות כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות thermocycler על 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן עד 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 30 μl של המדגם כל 10 μl של הסמן חלבון על ג&#39;ל טריס-גליצין 10-20%. שמור את שארית המדגם עבור חלק 3.1. טען 10μl של דה מרקר ColorPlus חלבון Prestained. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese את הג&#39;ל על 130 וולט בטמפרטורת החדר עד הכניסה לצבוע קרוב לתחתית הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ג&#39;ל סיימה ריצה, להסיר את הג&#39;ל של השחקנים ולמקם אותו בתוך קופסת פלסטיק קטנה עם מספיק Coomasie כתם כחול על מנת לכסות את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם ג&#39;ל למשך שעה 1 עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;ל שלוש פעמים במשך 30 דקות ב 50 מ&quot;ל של תמיסת destain. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את התמונות באמצעות transilluminator אור לבן או סורק. לחלופין, ג&#39;ל יכול להיות מיובש בין דפי צלופן בתוך מסגרת. </li></ol> 3. Pro-Q אמרלד 300 לגילוי של חלבונים glycosylated ב SDS-PAGE ג&#39;לים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל הג&#39;ל ב 2.1), עומס יתר של הדגימות על הג&#39;ל טריס-גליצין 10-20%. טען 10 &amp; mu; L של דה מרקר חלבון ColorPlus Prestained. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הג&#39;ל פועל לפרק את מגיב Pro-Q אמרלד עם DMF ולהכין את תקן מלאי, שטפי ואת חמצון פתרונות אמרלד Pro-Q 300 כתם הבאים במדריך מוצר המסופק עם הערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אלקטרופורזה תושלם, להסיר את הג&#39;ל מתוך יצוק למקם אותו בתוך קופסת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הג&#39;ל על ידי הוספת 100 מ&quot;ל של הפתרון לתקן ולהשאיר אותו לילה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;ל עם 100 מ&quot;ל של הפתרון לשטוף עבור 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר בהתרגשות גוי. חזור על לשטוף עם פתרון לשטוף טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמצן את הפחמימות על ידי דוגרים את הג&#39;ל עם תסיסה עדינה במשך 30 דקות ב 25 מ&quot;ל של חמצון פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;ל כמתואר בשלב 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הוא ג&#39;ל כביסה להכין טרי Pro-Q אמרלד 300 כתם על ידי הוספת 500 μl של הפתרון Pro-Q 300 מגיב אמרלד מומס צעד 3.2 ל 25 מ&quot;ל שלמכתים חיץ המסופק בערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם ג&#39;ל על ידי הוספת 25 מ&quot;ל של הכתם מוכן בשלב 3.8 ו דוגרים בחושך עם תסיסה עדינה במשך 90 עד 120 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שני השלבים המתוארים לשטוף צעד 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את התמונות עם transilluminator UV ב 300nm. השתמש בסמן 80 kDa, אשר מסומן עם Pro-Q אמרלד גרין, לחפוף את התמונה UV לתמונה אור לבן של הג&#39;ל המציגה את הסולם prestained. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את התמונות של הג&#39;ל מוכתם Coomasie בשלב 2.10 עם ג&#39;ל האזמרגד Pro-Q מוכתם משלב 3.11. </li></ol> 4. נציג תוצאות השינויים הגירה חלבון לאחר deglycosylation האנזימטית מוצגות באיור 2. השווה את מדגם הביקורת (לוח א &#39;, מסלול 1) עם הטיפול F PNGase (הסרת N-glycans, מסלול 2), מערבבים Deglycosylation (PNGase F; פלוס אנדו ו exoglycosidases להסיר O-glycans, מסלול 3). הפחתה נוספת לאבגודל נתפס לאחר עיכול עם glycosidases נוספים (מסלול 4). מלבד שינוי המוני, להקות להיות חדה כמו glycans יוסרו. הלהקה פועלת תחת סמן 17 kDa (כוכבית) מייצג את (MW: 16 KDA) deglycosylated מלא hCGβ פוליפפטיד. להקות אחרות שאולי נובעות deglycosylation שלם או את החלבונים מזוהה מרובים הנוכחי במדגם hCGβ (ראה מסלול 1). Lanes 5-7 (שולטת) להראות את להקות המתאימים glycosidases. מכתים גליקופרוטאין ידי אמרלד גרין מוצג בלוח זה ב מגיב oxidizes וכתמים כל glycans נוכח מולקולת חלבון. לכן עוצמת האות יורדת ככל hCGβ הוא deglycosylated enzymatically (מסלול 1 לנתיב 4). האות שיורית במסלולים 3 ו -4 להעיד על נוכחות של מוטיבים glycan, אשר עמידים בפני אנזימים בשימוש. Glycosidases נוספים המשמשים במסלול 4 להסיר שאריות כמה סוכר נוסף: ההגירה חלבון זהה, אבלירידה קלה בעוצמה של מכתים ניתן לראות. Moieties סוכר עמיד לא נכחו כל מיני חלבון: כמה להקות לא היו מזוהים על ידי אמרלד גרין (נעדר בתמונה UV, בסוגריים), המציין שהם deglycosylated בהרחבה. נתונים נוספים תומכים למסקנה hCGβ glycosylated הוא הטרוגני. הלהקה נמוך על מסלול 2 (חץ) הוא קלוש על התמונה אמרלד גרין, בעוד הלהקה העליון על מסלול 2 הוא בהיר, המציין כי הרבה קבוצות glycans עדיין קיימות. נתונים אלו מחזקים את המסקנה כי hCGβ רקומביננטי לידי ביטוי בתאים העכבר מכיל glycoforms מספר 9. אלה glycoforms שונים הן בשל ההטרוגניות הטבועה glycosylation שם כמה פוליפפטידים לא מקבלים glycan בכל אתר הסכמה ו / או כמה glycans מורחבות וחלקם אפילו על אותו חלבון לא. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" /> באיור 1.Glycosylation דפוסים אופייניים המופרשים או גליקופרוטאינים על פני קרום התא. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" /> 2. איור SDS-PAGE ג&#39;לים מראה deglycosylation האנזימטית של hCGβ. לוח מראה כתמים כחולים Coomasie תוך לוח B מראה את התוצאות של Pro-Q אמרלד 300 עבור להדמיה של חלבונים glycosylated. מספר דוגמאות: 1, שליטה hCGβ; 2, PNGase F העיכול; 3, מערבבים העיכול Deglycosylation: 4, מערבבים Deglycosylation פלוס עיכול exoglycosidases, דגימות 5-7 הם שולטת מגיב (O-Glyc, O-Glycosidase; GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Fucosidase גל / Fuc, β1-3 Galactosidase, α1-3, 6 Galactosidase ו α1-2; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, neuraminidase; PNGase; F PNGase)

<ol>
	<li>Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation:+nature,+distribution,+enzymatic+formation,+and+disease+implications+of+glycopeptide+bonds.">Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds.</a> Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).</li><li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+in+Cellular+Mechanisms+of+Health+and+Disease.">Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease.</a> Cell. 126, 855-867 (2006).</li><li>Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+glycosylation+on+the+biological+function+and+structure+of+human+immunoglobulins.">The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.</a> Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).</li><li>Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+oligosaccharides+as+outfitters+for+glycoprotein+folding,+form+and+function.">N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).</li><li>Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chorionic+gonadotropin.+Linear+amino+acid+sequence+of+the+beta+subunit.">Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit.</a> Journal of Biological Chemistry. 248 (19), 6810-6812 (1973).</li><li>Tarentino, A. L., Plummer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deglycosylation+of+Asparagine-linked+Glycans+by+PNGaseF.">Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF.</a> Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5 (23), 163-170 (1993).</li><li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine+amidase+F+cannot+release+glycans+with+fucose+attached+&#945;1-3+to+the+asparagine-linked+N-acetylglucosamine+residue.">Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached &#945;1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).</li><li>Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidases+with+broader+substrate+specificity.">Novel endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity.</a> Glycobiology. 18 (10), 799-805 (2008).</li><li>Thakur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+glycoforms+of+the+intact+alpha+subunit+of+recombinant+human+chorionic+gonadotropin+by+high-resolution+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (2), 8900-8907 (2009).</li><li>Park, S., Lee, M. R., Shin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+microarrays+as+powerful+tools+in+studies+of+carbohydrate-mediated+biological+processes.">Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes.</a> Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).</li><li>Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+analysis+of+proteins+modified+by+O-linked+N-acetylglucosamine.">Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).</li><li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essentials of Glycobiology. , (2008).</li></ol>

המחברים הם מועסקים על ידי ניו אינגלנד Biolabs, המייצר חומרים כימיים רבים המשמשים במאמר זה.

השיטה המתוארת כאן על ידי שימוש deglycosylation האנזימטית SDS-PAGE יכול לספק מידע רב ערך על מצב glycosylation של חלבון של עניין, בעוד glycan ספציפי ריאגנטים להקל על הפרשנות של הנתונים. פרוטוקול זה מיועד המחקרים הראשוניים של glycosylation חלבון זה מתאים במיוחד עבור הפרשה ואת גליקופרוטאינים בממברנה של בתאי יונקים: האנזימים נבחר במקרה הזה יהיה דווקא להסיר את כל N-glycans, ו או N-glycans פלוס ואת סוכרים הנפוצים ביותר הארכת ויוצרים הליבה של O-glycans. Glycosidases יש את היתרון הנוסף של להיות קלה, בהשוואה לשיטות deglycosylation כימיים, תוך שמירה על שלמות עמוד השדרה הן סוכרים וחלבונים. כדי להבהיר את תפוסת (אשר חומצות אמינו הן glycosylated), היקף glycosylation, או על מנת לקבוע את המבנה העדין של glycans, טכניקות מתוחכמות יותר, כגון מ &#39;ספקטרומטריית התחת, כרומטוגרפיה נוזלית או NMR נדרשים. בגלל הפשטות שלו, מספר צעדים בפרוטוקול זה יכול להיות מותאם, להחליף ו / או בשילוב כדי להתאים לצרכים ניסיוניים שונים. עם זאת, על מנת להשיג תוצאות כי ניתן לפרש בבירור חשוב להבין את נקודות החוזק שלו ואת המגבלות. ראשית, סגוליות וטוהר glycosidases הם קריטיים: אנזימים היטב מאופיין רק נבדק להשתחרר פרוטאזות ופעילויות מזהמים אחרים יש להשתמש. למרבה הצער, אין תקן יחידת אנזים הגדרה glycosidases: המשתמש צריך לקבוע את התחליף המתאים על פי מפרט של היצרן. שנית, בחירה זהירה של זיהוי צורך: א) מכתים ריאגנטים חלבון שימושיים רק אם תוצאות deglycosylation בשינוי משמעותי מסה מולקולרית. תוצאה כזו ברורה כפי שמוצג כאן לא מתקבל תמיד. במקרים אחרים, שראינו mi נורמליgration לאחר deglycosylation (רחוק משקל מולקולרי חזה, או אפילו הגירה איטי יותר). תופעה זו אינה מובנת היטב, אך ניתן לומר כי כל שינוי הגירה ראיות כי החלבון כבר deglycosylated. ב) זיהוי סוכר עם נוגדנים מציבה אתגרים ייחודיים הגבלת התחולה שלהם. זה כבר קשה מאוד כדי ליצור כללי אנטי glycan נוגדנים, הם גדלים בדרך כלל נגד יעד glycan מורכבים, אשר מגבילה את השימוש בהם. יתר על כן, מספר חד שבטיים נוגדנים נגד glycan להציג תגובתיות לחצות רצויים 10. ג) לקטינים (חלבונים עם סוכר זיקה מהותית) מתאימים היטב לאיתור סוכר, ובנוסף הם נותנים תובנה על מבנה glycan. עם זאת, לא כולם יש סגוליות צר; רבים מאופיינים באופן חלקי בלבד (כלומר, הם יכלו זיקות לא ידוע). בתור מכתים חיובי תוצאה מספקת לקטינים, אינדיקציה לא הוכחה, נוכחותם של given סוכר. ד) ערכות כימית תיוג (מבוסס על periodate חמצון של סוכרים) הן את שיטת הבחירה להכתים את כל גליקופרוטאינים, ומתאים וכך גם לעקוב deglycosylation. כאשר עיבוד מדגם לא ידוע, זהו תרגול טוב כדי לכלול שולטת גליקופרוטאין. Fetuin הוא N זמינים - ו - O-גליקופרוטאין, גונדוטרופין כוריוני (הן יחידות משנה) היא גם בחירה טובה. שור אלבומין (BSA) יכול לשמש כביקורת שלילית. עם זאת, יש לציין כי חלק לא glycosylated חלבונים להגיב עם מעט אמרלד Pro-Q 300, במיוחד כאשר נעשה שימוש בריכוזים גבוהים. Non-glycosylated סטנדרטים משקל מולקולרי, כגון סמן את החלבון prestained שימוש בפרוטוקול זה, יש את היתרון של הצגת להקות חדה. רק במקרה אחד של החלבונים האלה (80 KDA) תגובתי Pro-Q אמרלד 300. לכן, ייתכן שהמשתמש רוצה להפעיל סולם רגיל גליקופרוטאין במקום, כמו קנדי ​​מ-Cane Invitrogeהערה לבסוף, זיהוי פשוט ג&#39;ל של גליקופרוטאינים nucleocytosolic (אשר שונה עם אחד O-GlcNAc) אפשרי עם שימוש של נוגדנים חד שבטיים, יחד β-N-Acetylglucosaminidase שליטה סגוליות 11. התיאור של טכניקה זו היא מעבר היקפו של מאמר זה, אבל זה צריך להיות כאמור glycosidases הם כלי שימושי לחקר גליקופרוטאינים אחרים glycoconjugates רבים הנמצאים בתאים. טיפול מקיף של כל הצורות הידועות של glycosylation ניתן למצוא במהדורה השנייה של &quot;יסודות של glycobiology&quot;; מקוון חינם בכתובת מדף הספרים צמח השדה (ID Bookshelf: NBK1908; PMID: 20301239) 12.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> האדם β גונדוטרופין כוריוני </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> C6572 </td><td></td></tr><tr><td> מנורות ה-PCR </td><td> VWR </td><td> 20170-004 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Thermocycler </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4359659 </td><td></td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0704 </td><td> מסופקים עם חוצצי </td></tr><tr><td> Deglycosylation חלבון מערבבים </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P6039 </td><td> מסופקים עם חוצצי </td></tr><tr><td> α-N-Acetylglalactosaminidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0734 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> α1-2 Fucosidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0724 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> α1-3, 6 Galactosidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0731 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> β1-3 Galactosidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0726 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> מאגר 10X ה-G7 (500 סודיום פוספט mM) </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> --- </td><td> מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix </td></tr><tr><td> גליקופרוטאין הצפת 10X Denaturing (5% SDS, 400 מ&quot;מ DTT) </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> --- </td><td> מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> --- </td><td> מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix </td></tr><tr><td> 3X SDS טוען חיץ (187.5 mM טריס-HCl pH 6.8, SDS 6%, 30% גליצרול, ברום 0.03%ophenol כחול) </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> B7703 </td><td> מסופקים עם 1.25M DTT </td></tr><tr><td> ColorPlus Prestained מרקר חלבון </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P7709 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% טריס-גליצין Multigel </td><td> קוזמו ביו ושות </td><td> DCB-414893 </td><td></td></tr><tr><td> אלקטרופורזה קלטת יחידה </td><td> קוזמו ביו ושות </td><td> DCB-303111 </td><td></td></tr><tr><td> Power Supply אלקטרופורזה EPS 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Q אמרלד 300 גליקופרוטאין כתמים Kit </td><td> Invitrogen </td><td> P-21857 </td><td></td></tr><tr><td> בריליאנט בלו R </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> B0149 </td><td></td></tr><tr><td> AlphaImager HP System </td><td> תא Biosciences </td><td> 92-13823-00 </td><td></td></tr></tbody></table>

identification and characterization of protein glycosylation using specific endo- and exoglycosidases

Glycosylation, תוספת של סוכרים קשורים קוולנטית, הוא שינוי חשוב שלאחר translational של חלבונים יכול להשפיע באופן משמעותי על תהליכים כגון הידבקות התא, סחר מולקולרית, אישור, ואת הולכת אותות 1-4. ב אאוקריוטים, את השינויים glycosylation הנפוץ ביותר במסלול הפרשה הן תוספות ב asparagine שאריות הקונצנזוס (N-linked); או סרין או תראונין שאריות (O-linked) (איור 1). ייזום סינתזה של N-glycan נשמרת מאוד אאוקריוטים, בעוד מוצרי קצה יכולים להשתנות במידה רבה בין המינים, רקמות שונות, או חלבונים. Glycans חלקם יישארו ללא שינוי (&quot;גבוה מנוז N-glycans&quot;) או עיבוד נוסף של Golgi (&quot;מורכב N-glycans&quot;). המגוון הגדול נמצא עבור O-glycans, אשר מתחיל עם משקע משותף (GalNAc) N-Acetylgalactosamine בתאים חיים, אך נבדלים אורגניזמים נמוכה 1. אף אוזן גרון &quot;&gt; ניתוח מפורט של glycosylation של חלבונים הוא תחום בפני עצמו ודורש משאבים רבים ומומחיות כדי לבצע כראוי. עם זאת מגוון רחב של אנזימים זמין להסיר סוכרים (glycosidases) מאפשר לקבל מושג כללי על המצב של glycosylation . חלבון במעבדה הגדרה סטנדרטית כאן אנו מדגימים את השימוש glycosidases לניתוח גליקופרוטאין מודל:. רקומביננטי גונדוטרופין כוריוני אנושי בטא (hCGβ), אשר מחזיקה שני N-glycans וארבעה O-glycans 5 הטכניקה פשוטה דורשת רק מכשור וחומרים מתכלים טיפוסי, והוא יכול להתאים בקלות ניתוח של דגימות גליקופרוטאין מרובים. מספר אנזימים יכול לשמש במקביל מחקר גליקופרוטאין. PNGase F הוא מסוגל להסיר כמעט את כל סוגי N-linked glycans 6,7. עבור O-glycans, אין אנזים זמין לדבוק יכול oligosaccharide שלמים מתוך הדואר עמוד השדרה חלבון. במקום זאת, O-glycans הם גזומים ידי exoglycosidases לליבה קצר, אשר לאחר מכן להסיר בקלות על ידי Glycosidase-O. מערבבים Deglycosylation חלבון מכיל PNGase F, O-Glycosidase, neuraminidase (sialidase), β1-4 Galactosidase, ו β-N-Acetylglucosaminidase. הוא משמש בו זמנית להסיר N-glycans וכמה O-glycans 8. לבסוף, מערבבים את Deglycosylation נוספו בתערובת של exoglycosidases אחרים (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 Galactosidase ו β1 Galactosidase-3), אשר מסייעים להסיר מונוסכרידים עמידים אחרת זה יכול להיות נוכח בטוח O-glycans. SDS-PAGE/Coomasie הכחול משמש כדי להמחיש הבדלים הגירה חלבון לפני ואחרי הטיפול glycosidase. בנוסף, סוכר ספציפי שיטה מכתים, ProQ אמרלד-300, מראה אות פחתה כפי glycans הם succeהוסר ssively. פרוטוקול זה מיועד לניתוח של כמויות קטנות של גליקופרוטאין (0.5-2 מיקרוגרם), למרות deglycosylation האנזימטית וניתן לשנותם עד כדי להכיל כמויות גדולות יותר של חלבון לפי הצורך.

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases at JoVE.com

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

שימוש glycosidases ספציפי להסיר סוכרים מן גליקופרוטאינים ואחריו SDS-PAGE היא שיטה ערך כדי לזהות שינויים glycan על דגימות חלבון היא בחירה טובה עבור מחקרים glycobiology הראשונית. השינויים הבאים deglycosylation ניתן לאתר כמו משמרות ניידות ג&#39;ל או מכתים עם ריאגנטים רגיש glycan.

זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...