Name: imaging of hiv-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00
Duration: 11 min 45 s
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Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse AI071815 (CEH) und der Roadmap Nanomedizin Development Center Award PN2EY016586 (MLD) unterstützt.

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	<li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions.">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li><li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58.">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li><li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity.">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li><li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1.">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li><li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li><li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions.">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li><li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus.">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization.">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4++T+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li><li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes.">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li></ol>

Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.

Frühere Studien haben visualisiert VS in der Zell-Zell-Konjugat-System, aber diese Studien nicht liefern Bilder von hoher Auflösung genug, um die supramolekularen Strukturen an der Synapse zu visualisieren. In unserem Labor verwendeten wir das Glas-unterstützten ebene Bilayer-System, um die Oberfläche der infizierten Zellen, die Virushülle gp120 und die zelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1 darstellen. In Verbindung mit TIRF Mikroskopie, die Fluoreszenz-Signale erkennt innerhalb 100-200 nm aus der Doppelschicht Oberfläche mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis, konnten wir supramolekularen Trennung von gp120 von ICAM-1 in der VS zu erfassen. Darüber hinaus kann die Standard-Immunfärbung Verfahren zur Doppelschicht-System angewendet werden und ist auch hier zu erkennen und zu quantifizieren, die spezifische Einstellung von aktiven Lck, nicht aber Fyn, der gp120-Kontaktfläche an VS 15. Daher bietet die planare Doppelschicht ein experimentelles System für hochauflösende Bildgebung von Synapse-Schnittstelle in einer 2D-Ebene durch TIRF-Mikroskopie sowie Weitwinkel-oder konfokale Beleuchtung Methoden. Allerdings ist das System auch Einschränkungen Einstellen Liganden Mobilität, out-of-plane, und Schwankungen von biologischen Membranen werden durch planare Doppelschichten wiedergegeben. Darüber hinaus ist dies ein in vitro-System und hat daher andere Einschränkungen, wie der Mangel an anderen Membran-Moleküle, die vorhanden sein auf einer infizierten Zelle und des Zytoskeletts Maschinen, die molekularen und zellulären Mobilität Motilität reguliert würden. Auch können die Dynamik und Verteilung der Moleküle, wie Trimeren gegenüber Monomeren von gp120, physiologisch nicht auf dem Doppelschichtkern dargestellt werden. Doch selbst mit diesen Einschränkungen ist dieses System noch sehr wertvoll für das Studium Virus-Zell-oder Zell-Zell-Interaktionen, und diese Methoden können als nützlicher Leitfaden für Forscher, die versuchen Bilder mit hoher Auflösung sind supramolekulare Organisation erkennen zu dienen, die nicht erkennbar ist bei dem herkömmlichen Zell-Zell-konjugiertes System.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> His-markierten HIV-gp120 </td><td> Geschenk von Dr. Cho </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> His-markierten HIV-gp120 </td><td> Immun-Technologie </td><td></td><td> Verschiedene X4 oder R5 Tropic </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medical Company </td><td> 521302 </td><td> Human Serum Albumin 25% </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-Zentrifugalmühle Filter </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Lck Kaninchen mAb </td><td> Cell Signaling </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> p-Lck Rabbit pAb </td><td> Santa Cruz Biotechnology Inc. </td><td> Sc-101728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fyn Kaninchen mAb </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-20000 </td><td> Carbonsäure Succinimidylester </td></tr><tr><td> FCS2 Kammer </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 30mm Round w / Löcher </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0,75 mm dick </td></tr><tr><td> Rectangle-Dichtung </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0,25 mm dick </td></tr><tr><td> Tygon-Schlauch </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25 Fuß) </td></tr><tr><td> Dreiwegehahn </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> Zwei-Wege-Hahn </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Sticky Slide ich 0,2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml-Spritze </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> DOGS-NTA </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40mm </td></tr><tr><td> TIRF-Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

imaging of hiv-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers

Humane Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) Infektion erfolgt höchst effizient über Zelle zu Zelle Übertragung 2,10,11. Diese Zelle zu Zelle zwischen CD4 + T-Zellen ist die Bildung einer virologischen Synapse (VS), die eine F-Aktin-abhängigen Zell-Zell-Übergang auf den Eingriff von HIV-1 envelope gp120 auf der infizierten Zelle mit CD4 und ausgebildet ist das Chemokinrezeptor (CKR) CCR5 oder CXCR4 auf der Zielzelle 8. Zusätzlich zu gp120 an die Rezeptoren, andere Membranproteine, insbesondere das Adhäsionsmolekül LFA-1 und seinen Liganden, die ICAM-Familie spielen eine wichtige Rolle bei der Bildung und VS eine Übertragung des Virus, wie sie auf der Oberfläche von virusinfizierten Donorzellen und Zielzellen, als auch auf der Hülle von HIV-1-Virionen 1,4,5,6,7,13. VS Bildung wird durch intrazelluläre Signalwege, die als Ergebnis von gp120-Eingriff seiner Rezeptoren transduziert begleitet. In der Tat haben wir kürzlich zeigen, dass CD4 &lt;sup&gt; + T-Zell-Interaktion mit gp120 Einstellung und Phosphorylierung von Signalmolekülen mit dem TCR Signalosom einschließlich Lck, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76 Itk und PLCγ 15 zugeordnet induziert. In diesem Artikel stellen wir eine Methode, um supramolekulare Anordnung und Membran-proximalen Signalisierung Veranstaltungen im Verlauf VS Bildung sichtbar zu machen. Wir nutzen das Glas-unterstützten ebenen Bi-Schicht System nach einem reduktionistischen Modells, um die Oberfläche von HIV-infizierten Zellen, die das virale Hüll-gp120 und die zelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1 darstellen. Das Protokoll beschreibt allgemeine Verfahren für die Überwachung von HIV-1 gp120-induzierte VS und Signal-Aktivierung Ereignisse, die i) bi-Schicht Vorbereitung und Montage in einer Flusszelle umfassen, ii) Injektion von Zellen und Immunfluoreszenzfärbung an intrazellulären Signalmolekülen auf Zellen interagieren erkennen mit HIV-1 gp120 und ICAM-1 auf bi-Schichten, iii) Bildaufnahme durch TIRF-Mikroskopie, einnd iv) Analyse der Daten. Dieses System erzeugt Bilder mit hoher Auflösung von VS-Schnittstelle darüber hinaus mit dem herkömmlichen Zell-Zell-System erreicht, wie sie abhängig vom Erfassen unterschiedliche Cluster von einzelnen molekularen Komponenten der VS ermöglicht zusammen mit Signalmoleküle rekrutiert, um diesen Sub-Domains.

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Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bildung einer HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsen auf Glas unterstützt planare Doppelschichten durch Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie sichtbar zu machen. Das Verfahren kann auch mit Immunfluoreszenzfärbung kombiniert werden, um die Aktivierung und Umverteilung von Signalmolekülen, die während der HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsenbildung auftreten zu erkennen.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Forschung

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