Name: imaging of hiv-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH bidrag AI071815 (CEH) och färdplanen nanomedicin Development Center utmärkelsen PN2EY016586 (MLD).

1. Märkning GP120 Fluorescerande färgämnen som används i detta protokoll är effektiva för att binda till proteiner, är tillräckligt foto-stabil för mikroskopi avbildning, och matcha exciteringsvåglängder av lasrar som finns med vårt mikroskop. Dessa tre kriterier måste uppfyllas vid val fluorescerande molekyler för taggning proteiner. <ol><li> Utbyte His 6-taggade gp120 DH12 (en gåva från Dr Michael Cho, lowa State University) proteinet buffert till steril PBS med användning av en centrifugal-filterenhet (30 kDa MWCO). Se gp120 koncentrationen inte är mer än 1 mg / ml. Obs: Hans 6-märkt gp 120 proteiner från andra X4 eller R5 tropiska stammar har också testats och finns nu kommersiellt tillgängliga från Immune Technologies. </li><li> Tillsätt natriumkarbonat 9,0 bikarbonat pH till proteinlösningen för att erhålla 50 mM slutkoncentration av natriumbikarbonat med ~ pH 8,5. </li><li> Tillsätt aminreaktiva Alexa Fluor 488 (AF488) fluorescerande färgämne, vilket är dissolved i vatten vid en 10-faldigt molärt överskott. Inkubera denna blandning under 1-2 timmar vid rumstemperatur i mörker. </li><li> Att avlägsna överskott av färgämne, använd centri filterenheten såsom tidigare och tillsätt färsk steril PBS till kolonnen. Upprepa detta steg tills alla fritt färgämne tas bort (3-4 tvättar med 4 ml PBS). Centrifugera ner tills gp120 koncentreras till ca 1 mg / ml. Anm: Borttagning av fritt färgämne genom dialys eller centrifugal filterenhet fungerar bara om färgämnet är vattenlöslig, eller också gelfiltrering användas. </li><li> Att mäta fluorescensintensiteten per molekyl av protein (F / P) av det märkta proteinet, bestämning av koncentrationerna (i ^ M) av det fluorescerande färgämnet på lämplig våglängd (t.ex. vid 488 nm för AlexaFluor 488) och protein (vi använder en NanoDrop spektrofotometer med de så kallade proteiner och etiketter &#39;inställning) och sedan dela upp dessa två siffror ger dig F / P-förhållande. Samma förfarande används för andra proteiner och färgämnen såsom ICAM-1 och Cy5. Obs: Andra typer av spectrophotometers kan användas för att erhålla den proteinkoncentration och fluorescerande färgämne koncentration för att erhålla F / P-förhållande om en NanoDrop inte är tillgänglig. </li></ol> 2. Flödescell Montering och biskikt Förberedelse Det allmänna förfarandet för flödescellen och tvåskikts framställning har beskrivits i detalj tidigare 14. Här redogör vi för specifikt protokoll för att förbereda dubbelskikten innehåller hans 6-taggade gp120 DH12 på Bioptech flödescell. För studier med infektiösa virus eller infekterade celler och när små volymer är nödvändiga på grund av begränsade reagenser, en engångs Ibidi flödeskammare (klibbigt Slide I 0,2 Luer) kan användas och följas med samma tvåskiktskomposition förfarande steg 2,4-2,9. Information för Ibidi flödeskamrarna kan erhållas från bolagets hemsida, <a href="http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf">http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf</a> </a&gt;. <ol><li> Framställ Pirhana lösning (45 ml svavelsyra (Spårmetallösning Grad 98%) och 15 ml 30% väteperoxid) 14. Med plast klämmor, glider sänk omslaget i Pirhana lösningen i 15 minuter. </li><li> Överföring täckglas till en bägare fylld med pica-renat vatten och tvätta varje under rinnande vatten i 2 minuter (en minut på varje sida). Placera på rack för att torka. </li><li> Montera Bioptechs FCSII kamrarna såsom tidigare beskrivits 14. </li><li> En liposom blandning innehållande 12,5% Ni 2 + komplexbildare lipider används för att fånga och presentera hans 6-gp120 på dubbelskiktet ytan 16. Tillsätt 1 pl droppar av liposomer blandningen på microaqueduct bilden utan att röra spetsen på glaset. För att förbereda max 5 biskikt per flödescell, upprepar upp till 4 gånger så att det finns fem 1 pl punkter som visats tidigare 14. </li><li> Placera täckglas ovanpå lipider. Täck den vita stoppringen med rostfri clAMP basenhet, vända hela apparaten över och täta. Markera platsen för dubbelskikt med en markör. Inkubera under 10 min vid rumstemperatur. </li><li> Fäst slang med två-vägs kran till vänster perfusion röret, som visas i video. Generera en positiv menisk vid slutet av slangen med 3-vägs avstängningskran på den (slang har tidigare fyllts med HEPES-buffrad saltlösning (HBS) innehållande humant serumalbumin (HSA) (HBS / HSA: 50 ml 10X HBS [10x HEPES-buffrad saltlösning: 200 mM HEPES, pH 7,2, 1,37 M NaCl, 50 mM KCl, 7 mM Na HPO 2 4 och 60 mM D-glukos] 20 ml 25x HSA, 500 | il 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgCl2 och dH 2 0 för att få en total volym 500 ml och filtret med 0,22 filter) och saknar bubblor. Anslut slang till höger perfusion röret och tryck försiktigt buffert genom flödescell. </li><li> Blockera dubbelskikt med ~ 300 | il av kasein innehållande 100 pM NiCl2 genom att fylla 1 ml spruta och fästa till den öppna delen av 3-vägs avstängningskran. Gently driva buffert igenom och stänga båda kranarna innan koppla ur sprutan. Inkubera under 30 min vid rumstemperatur. </li><li> Tillsätt His 6-taggad AF488-märkt gp120 (koncentrationen bestäms såsom beskrivits tidigare i 16). Vi använder ~ 250 molekyler av gp120/μm 2 för att efterlikna den lokala densiteten av Env kluster hittas på HIV-1-virion yta 17. På liknande sätt använder vi ~ 250 molekyler / xm 2 av ICAM-1 på dubbelskiktet såsom tidigare rapporterats 14. Ladda i flödescell som görs med kasein. Inkubera under 30 min i mörker (täcka med folie) vid rumstemperatur. Samma förfarande användes för att införliva andra proteiner såsom His 12-märkt Cy5-märkt ICAM-1 på dubbelskiktet. </li><li> Tvätta dubbelskikt med 5 ml buffert. </li></ol> 3. Kvalitetskontroll av biskikt via FRAP Proteiner i dubbelskikt måste vara sidled diffunderbart. Före tillsats av cellerna till dubbelskikt, är det viktigt att säkerställarörligheten hos proteiner i det preparerade dubbelskiktet. Här beskriver vi ett fluorescerande återhämtning efter fotoblekning (FRAP) metod 3 som kan utföras manuellt på de flesta objektiva upplyst TIRF, brett fält epifluorescens eller laserskanning konfokala mikroskop. Målet är att bilden helt enhetliga fält av fluorescens i lipidbiskiktet, blekmedel en plats, och att övervaka återkomst osläckta molekyler till blekta området. En återvinning av 50% i 2 minuter kan vara acceptabla. Alla de stora tillverkarna mikroskop (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) sälja objektiva upplysta TIRF system som fungerar bra för denna applikation. Även om varje företag erbjuder olika varianter av TIRF belysning och andra operativa funktioner är bildkvaliteten i stort sett samma. <ol><li> Använda en låg excitationsintensiteten för att minimera blekning. Använda en hög numerisk apertur mål såsom en NA 1,3 till 1,45 40x, 60x eller 100x. När du använder en standard fluorescerande eller TIRF mikroskop, för att minska de lätta intenshet, lägg neutrala densitet filter i excitationsljuset vägen. De flesta lasersystem kan fastställas för låg belysning genom att sätta en acusto optiskt avstämbara filter (AOTF) eller acusto optisk stråluppdelare (AOB-bakterier) med låg spänning. </li><li> Spela in ett &quot;pre-lut&quot; bild. Om du använder en kyld CCD-kamera, för att kompensera för dåliga ljusförhållanden binning kan sättas till 2x2 eller 4x4, kan förstärkningen sättas hög, eller lång exponering (till exempel på storleksordningen sekunder) kan användas. Om du använder en konfokal kan pinhole bländaren öppnas, förstärkning högt satt, och långsam skanning eller i genomsnitt används. </li><li> Blekmedel en fläck. Om du använder en standard fluorescens eller TIRF mikroskop, ta bort alla ND filter för att möjliggöra maximal intensitet belysning, stänga fältet membranet, och exponera provet för några sekunder. Om du använder en laser scanning konfokal anger den maximala lasereffekten och zooma in ca 4x till 8x att bleka en plats. En varning för konfokala användning: inte zooma i för hög eftersom dubbelskiktet kan skadas av excestande koncentrerades fotoner. </li><li> På tio till femton sekunders intervall, spela in bilder med samma belysning och inställningar inspelning som i 3,1 och 3,2. Inom två till tre minuter platsen skall återfå intensitet som närmar sig &quot;pre-lut&quot; bild. Snabb återhämtning är ett tecken på en framgångsrik mobil dubbelskikt. Om fläcken förblir mörk, och i synnerhet om kanten behåller hög kontrast, de fluorescerande proteinerna är orörliga i dubbelskiktet och bör inte användas för experimentet. </li></ol> Obs: I vår nuvarande mikroskop kan vi leverera 0,9 mW av 641 nm ljus till en cirkulär fläck med en yta på 240 m 2, som bleker fluorescerande ICAM vid typiska koncentrationer på mindre än 4 sekunder. Läsarna tycker att kritiska inriktning av en Hg eller Xe lampa med blekning gånger mindre än 30 sekunder är mer än tillräckligt för att utföra denna analys på ett repeterbart sätt. Vi vill också hänvisa till referens 3 för ytterligare DETails. 4. Injektion av celler och immunofluorescensfärgning <ol><li> Värma upp flödescell till 37 ° C (detta kan göras i en 37 ° C inkubator med ingen CO2 under ca 30 min). </li><li> Tillsätt aktiverade humana CD4 + T-celler (2-5x10 6 /-flödescell) i HBS / HSA ~ 400 | il av 1 ml spruta. Låta cellerna fästa till dubbelskikt under ~ 45 min i 37 ° C inkubator. Om Ibidi kamrarna används, ge ytterligare buffert var 15-20 min. </li><li> Fixera cellerna genom att injicera 2% paraformaldehyd och inkubera under 10 min vid 37 ° C. </li><li> Tvätta 3x med 1 ml rumstemperatur PBS-buffert. Permeabilisera celler genom injektion av 0,1% Triton X-100 i 5 min vid rumstemperatur. </li><li> Tvätta 3x med 1 ml rumstemperatur PBS-buffert (när sökning efter fosforylerade proteiner, kan du lägga natriumvanadat vid 1 mM slutlig koncentration eller annan fosfatasinhibitor i PBS för att förhindra att avlägsna fosfat under bearbetning). Blockera användning av kasein med 5% getserum för25 min vid rumstemperatur. Den typ av djurserum beror på den sekundära antikroppen. </li><li> Tvätta 3x med 1 ml rumstemperatur PBS-buffert. Tillsätt primär antikropp i ~ 300 | il buffert /-flödescell under 30 min - 1 h vid rumstemperatur. För att upptäcka den inledande membran-proximal aktiveringssignal använder vi antikroppar som är specifika för fosforylerat Lek (pLck), totalt Lek eller Fyn. </li><li> Tvätta 3x med 1 ml rumstemperatur PBS-buffert. Tillsätt lämplig fluorescensmärkt sekundär antikropp i buffertlösning såsom görs med primär antikropp. För våra experiment använder vi Alexa Fluor 568-märkt get-anti-kanin sekundär. Inkubera under 20 min vid rumstemperatur. Tvätta 3x med 1 ml PBS-buffert. </li><li> OBS: Det är viktigt att ha en kontroll biskikt som behandlas med enbart sekundär antikropp (ingen primär antikropp). Följ steg 4,1-4,5 och hoppa 4,6, fortsätt sedan med steg 4,7. Detta kommer att bestämma nivån av icke-specifik bindning av en sekundär antikropp. Alternativt kan man använda direkt märkninged primära antikroppar. </li></ol> 5. Image förvärv av TIRF mikroskopi TIRF mikroskopi gör det möjligt excitation av fluorescerande signaler begränsade till en 250 nm eller tunnare plan på glassubstrat och cell-gränssnitt. Detta garanterar bild förvärv av endast signaler från lipiddubbelskiktet och från de omedelbart intill varandra placerade cellmembranen. Därför är det bara molekyler i synapsen avbildas. Eftersom TIRF avbildningar av membran-proximala området på botten av cellen, kommer proteiner som är internaliserade eller omfördelas i den dorsala membranet inte detekteras. Det kan då vara viktigt att ytterligare få bilder genom standard widefield eller konfokalmikroskopi att avgöra ackumulering eller distribution av proteinerna vid synaptiska området jämfört med andra volymer i cellen. Alla de stora tillverkarna mikroskop (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) sälja objektiva upplysta TIRF system som fungerar bra för APtillämpningen. Även om varje företag erbjuder olika varianter av TIRF belysning och andra operativa funktioner är bildkvaliteten i stort sett samma. Varje TIRF mikroskop har sina egna uppgifter för drift, men följande allmänna regler gälla för att erhålla hög upplösning. <ul><li> Belysning bör vara låg för att undvika blekning. </li><li> Kameran bör ha en linjär respons. </li><li> Kameran bör kunna imaging ett brett dynamiskt omfång utan mättnad. </li><li> Alla inställningar bör fastställas konstant för kvantitativa analyser. </li></ul> 6. Dataanalys För att studera intracellulära signaler aktiveras som ett resultat av CD4 + T-celler interaktion med gp120 på VS, är kvantitativa analyser av TIRF bilder göras för att avgöra om intracellulära signalmolekyler som Lek och Fyn aktiveras och rekryteras till synaps 15. Här beskriver vi en enkel metod som är tillämplig för de flesta bildanalysprogrampaket som ImageJ och Metamorph. Vi har använt ImageJ, som körs på Windows, Macintosh och Linux, för vår metod här 12. I Analysera&gt; Ställ Mått fliken, markera rutorna för området och menar grått värde. När du gör en region av intresse på bilden som är en polygon eller en frihand spåras sluten form och inte Analyze&gt; Mät, kommer programmet sätta data från denna mätning i en resultattabellen. Området kommer att vara i antalet pixlar eller i pm 2. Den är den genomsnittliga intensiteten i godtyckliga enheter. Det måste ha bakgrunden intensiteten subtraheras från den. Multiplicera den genomsnittliga minus bakgrunden efter område återgår den integrerade intensiteten av proteinet i godtyckliga enheter. <ol><li> Ställ mätningarna att betyda och område. </li><li> Öppna bilder för en experimentell villkor. </li><li> För varje cell, spåra och mäta regionen av intresse (medelvärde) och spåra och mäta ett område utanför regionen av intresse (bakgrund). </li><li> När du är klar med en experimentell villkor, antingen kopiera mätningar och klistra in i Excel eller annat kalkylprogram eller spara mätningarna. </li><li> Återgå till steg 6,2 för varje experimentell skick. </li><li> När mätningar är slutförda, beräkna resultaten. Formlerna är: Medelintensitet = betyder - bakgrund Integrerad intensitet = medelintensitet * området </li></ol> 7. Representativa resultat Att mäta aktivering och rekrytering av de initiala membran-proximala signalmolekyler Lek och Fyn som en följd av interaktion med gp 120 på VS, odlades primära humana CD4 + T-celler introducerades på dubbelskikt som bär gp120 och ICAM-1 15. Celler som införts för att dubbelskikten med endast ICAM-1 tjänade som en kontroll för att definiera de basala nivåer signalering. Spefika fluorescensintensitet mättes inom gp 120 kontaktytan för celler på gp 120 och ICAM-1 innehållande dubbelskikt och inom hela kontaktytan för celler som interagerar med ICAM-1 dubbelskikt. En ökning av genomsnittlig fluorescensintensitet är ett tecken på förhöjd rekrytering och aktivering av den signalerande molekylen till VS. Detta kommer att ytterligare visas genom en jämförbar ökning i den integrerade fluorescensintensiteten. Om emellertid det inte finns någon förändring i den integrerade fluorescensintensiteten, indikerar detta en omfördelning av den signalerande molekylen. Efter det att cellerna hade kontakt med dubbelskikt innehållande gp120 och ICAM-1, totalt Lck och pLck (Y394) rekryterades till VS-gränssnittet och samlokaliserades med gp 120 (fig. 1 och 2). Den genomsnittliga intensiteten hos den totala Lck (fig. 1) var högre i dubbelskiktet innehållande både gp120 och ICAM-1 än med ICAM-1 enbart, men de integrerade intensitet (fig 1) var liknande, vilket antyder att Lck omfördelas tillen central kluster vid CD4 + T-celler som binder till gp120. Emellertid visade kvantifiering av pLck (Y394) (fig 2) att den genomsnittliga intensiteten för gp 120 och ICAM-1 innehållande dubbelskikt var högre än den ICAM-1 enbart dubbelskikt, och den integrerade intensiteten var högre för dubbelskikt med både gp120 och ICAM -1 än på ICAM-1 enbart dubbelskikt. Detta indikerar att medan nivån av total Lek vid gränsytan är likartade i celler att vidhäfta till gp 120 och ICAM-1 och ICAM-1 enbart biskikt, gp120 bindning ökad fosforylering av återstoden Y394 vid Lck aktivering slingan. I motsats härtill var Fyn inte rekryterades till VS (fig. 3), mer Fyn var närvarande i kontaktytan hos celler på ICAM-1 enbart dubbelskikt än den dubbelskikt innehållande både gp120 och ICAM-1. Följaktligen drar vi slutsatsen att Lek, Fyn inte är den aktiva kinaset i den HIV-1 gp 120-inducerad VS. Siffror: Membran-proximal signalering vid HIV-1 gp120-inducerad VS. Bilder av representativa celler pågp 120 + ICAM-1 dubbelskikt (övre panel) och ICAM-1 dubbelskikt (bottenpanelema) visas. Fluorescensintensiteterna hos de individuella cellerna kvantifierades inom manuellt spåras områden av cellen fotavtryck såsom illustreras av området markerat med den gula ledningen i figur 1. Kvantifiering av genomsnittliga och integrerade intensiteter som upptäcks av TIRF mikroskopi presenteras i vänster och höger grafer, respektive. Totalt 30 till 350 celler kvantifierades för varje tillstånd. Staplar = 5 | im. Data från ett av tre upprepade experiment visas. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig1.jpg" /> Figur 1. CD4 + T-celler introducerades på dubbelskikt innehållande gp120 och ICAM-1 eller ICAM-1 enbart under 45 min och sedan fixeras och färgas för total Lek. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig2.jpg" /> Figur 2. CD4 + T-celler introducerades på biskiktetar innehållande gp120 och ICAM-1 eller ICAM-1 enbart under 45 min och sedan fixeras och färgas för pLck (Y394). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig3.jpg" /> Figur 3. CD4 + T-celler introducerades på dubbelskikt innehållande gp120 och ICAM-1 eller ICAM-1 enbart under 45 min och sedan fixeras och färgas för total Fyn.

<ol>
	<li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions.">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li><li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58.">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li><li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity.">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li><li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1.">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li><li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization.">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, S247-S254 (1998).</li><li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission.">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li><li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions.">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li><li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus.">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization.">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4++T+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li><li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes.">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li></ol>

Författarna förklarar några intressekonflikter.

Tidigare studier har visualiserat VS i cell-cell konjugatet systemet, men dessa studier inte gav bilder av tillräckligt hög upplösning för att visualisera supramolekylära strukturer på synapsen. I vårt laboratorium, använde vi den glas-uppburen plana dubbelskiktssystem att representera ytan av infekterade celler som uttrycker gp 120 virushöljet och den cellulära adhesionsmolekylen ICAM-1. I samband med TIRF mikroskopi, som känner fluorescens signaler inom 100-200 nm från dubbelskiktet yta med en hög signal-brus-förhållande, kunde vi upptäcka supramolekylär segregering av gp120 från ICAM-1 på VS. Dessutom kan den vanliga immunfärgning metod appliceras på biskiktet systemet och användes här för att detektera och kvantifiera specifika rekrytering av aktiv Lek, men inte Fyn, till gp 120-kontaktytan vid VS 15. Därför erbjuder den plana dubbelskiktet ett experimentellt system för hög upplösning avbildning av synaps gränssnitt i ett 2D-plan med TIRF mikroscopy, liksom brett fält eller konfokala belysning metoder. Emellertid har systemet också begränsningar som justering ligand rörlighet, out-of-planet böjning, och fluktuationer i biologiska membran som inte återges av plana biskikt. Dessutom är detta en in vitro-system och har därför andra begränsningar, såsom avsaknad av andra membranmolekyler som skulle vara närvarande på en infekterad cell och cytoskelettet maskiner som reglerar molekylär mobilitet och cellulär motilitet. Också kan dynamiken och distribution av de molekyler, såsom trimerer kontra monomerer av gp 120, som inte representeras fysiologiskt på det dubbla skiktet. Även med dessa begränsningar, är detta system fortfarande mycket värdefullt för att studera virus-cell eller cell-cell interaktioner, och dessa metoder kan fungera som en användbar guide till forskare som söker högupplösta bilder för att upptäcka supramolekylär organisation som inte märks i den konventionella cell-cell-konjugat systemet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> His-märkta HIV-gp 120 </td><td> Gåva från Dr Cho </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> His-märkta HIV-gp 120 </td><td> Immun-teknik </td><td></td><td> Olika X4 eller R5 tropiska </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medical Company </td><td> 521.302 </td><td> Human Serum Albumin 25% </td></tr><tr><td> Amicon Ultra centrifugalfilter </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Lck Kanin-mAb </td><td> Cellsignalering </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> p-Lek-Rabbit pAb </td><td> Santa Cruz Biotechnology Inc. </td><td> Sc-101.728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fyn Kanin-mAb </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> Get-anti-kanin-IgG (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> En-20000 </td><td> karboxylsyrasuccinimidylester </td></tr><tr><td> FCS2 avdelningen </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130.119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 30mm Rund w / hål </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0,75 tjocka </td></tr><tr><td> Rektangel Packning </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0,25 tjocka </td></tr><tr><td> Tygon-slang </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25ft) </td></tr><tr><td> Trevägskran </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> Två-vägs avstängningskran </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Klibbig Slide I 0,2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Täckglas </td><td> Ibidi </td><td> 10.812 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml spruta </td><td> BD </td><td> 309.659 </td><td></td></tr><tr><td> Hund-NTA </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Täckglas </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40mm </td></tr><tr><td> TIRF mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

imaging of hiv-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers

Humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) infektion inträffar mest effektivt genom cell till cell överföring 2,10,11. Denna cell till cell överföring mellan CD4 + T-celler innefattar bildningen av en virologisk synaps (VS), som är en F-aktin-beroende cell-cell-förbindningen utformad i samband med att HIV-1 gp 120 höljet på den infekterade cellen med CD4 och det kemokinreceptormålsökande (CKR) CCR5-eller CXCR4 på målcellen 8. Förutom att gp 120 och dess receptorer och andra membranproteiner, speciellt adhesionsmolekylen LFA-1 och dess ligander, ICAM-familjen spelar en viktig roll i bildningen VS och virus transmissionen som de är närvarande på ytan av virus-infekterade givarceller och målceller, såväl som på höljet av HIV-1-virioner 1,4,5,6,7,13. VS formation också åtföljs av intracellulära signalsystem händelser som omvandlade som ett resultat av gp120-engagemang av dess receptorer. Vi har faktiskt visade nyligen att CD4 &lt;sup&gt; + T-celler interaktion med gp120 inducerar rekrytering och fosforylering av signalmolekyler som är förknippade med TCR signalosome, inklusive Lek, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, itk och PLCy 15. I denna artikel presenterar vi en metod för att visualisera supramolekylär arrangemang och membran-proximala evenemang signalering som äger rum under VS bildning. Vi dra fördel av den glas-uppburen plana dubbelskikt systemet som en reduktionistiskt modell för att representera den yta av HIV-infekterade celler som bär det virala höljet gp120 och det cellulära adhesionsmolekylen ICAM-1. Protokollet beskriver allmänna förfaranden för att övervaka HIV-1 gp120-inducerad VS montering och signal händelser aktiveringsåtgärder som innehåller i) tvåskiktskomposition och sammansättning i en flödescell, ii) injektion av celler och immunofluorescensfärgning att upptäcka intracellulära signalmolekyler på celler samverkande med HIV-1 gp120 och ICAM-1 på bi-lager, iii) bild förvärv av TIRF mikroskopi, ettnd iv) analys av data. Detta system genererar högupplösta bilder av VS-gränssnitt utöver den som uppnås med den konventionella cell-cell-systemet som den tillåter detektion av olika kluster av individuella molekylära komponenter i VS tillsammans med specifika signalmolekyler rekryteras till dessa sub-domäner.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers at JoVE.com

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Den här artikeln beskrivs en metod för att visualisera bildandet av en HIV-1 hölje-inducerad virologisk synaps på glas som stöds plana dubbelskikten genom total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Metoden kan även kombineras med immunofluorescensfärgning att upptäcka aktivering och omfördelning av signalmolekyler som inträffar under HIV-1 hölje-inducerad virologiska synaps formation.

Avbildning av HIV-1 kuvert-inducerad Virologiskt Synapse och signalering av syntetiska lipiddubbelskikt

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediktion av HIV-1 coreceptor användning (Tropism) genom sekvensanalys med en genotypisk strategi

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating av HIV-1 kärnor

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nya verktyg för att expandera reglerande T-celler från HIV-1-infekterade individer

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformational Utvärdering av HIV-1 trimera Envelope Glycoproteins användning av en cellbaserad ELISA-analys

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-upplösning avbildning av Natural Killer Cell Immunologisk Synapse på en Glass-stött Planar lipidbiskiktet

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering av exosomes från plasma HIV-1 positiva individer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisering av HIV-1 Gag Bindning Giant enlamellvesikel (GUV) Membran

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

mätning av<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivitet av HIV-1 Preintegration Anläggningar

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC Based proteomik karakterisering av exosomes från HIV-1-infekterade celler

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...