Name: endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell to pancreatic insulin producing cells in a directed differentiation approach
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00
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Noi riconosciamo il sostegno NIH Innovator Award New DP2 116520 e ORAU Ralph Powe Facoltà Junior Enhancement Award.

1. Cella di manutenzione <ol><li> HESC H1 (WiCell) sono stati mantenuti hESC qualificati Matrigel pozzi rivestiti con mTeSR1 media, con i media cambiano ogni giorno. I pozzetti sono stati rivestiti con una soluzione diluita matrigel, preparata aggiungendo 300 pl di Matrigel hESC in 25 ml di DMEM: F12. 1 ml di questa soluzione Matrigel è stato aggiunto a ciascun pozzetto di una piastra ben sei, o 400 microlitri aggiunti a ciascun pozzetto di una piastra da 12 pozzetti e lasciate rivestimento per 1 ora a temperatura am...

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	<li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+:+de+la+transgression+de+l'embryon+humain+&#225;+la+m&#233;decine+r&#233;g&#233;n&#233;ratrice+de+demain.">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain &#225; la m&#233;decine r&#233;g&#233;n&#233;ratrice de demain.</a> Gyn&#233;cologie Obst&#233;trique &#38; Fertilit&#233;. 37, 620-626 (2009).</li><li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+Signals,+and+Lineages+in+Pancreas+Development.">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li><li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li><li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li><li>Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+human+ES+cells+and+iPS+cells+into+mature+pancreatic+insulin-producing+cells.">Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells.</a> Cell Res. 19, 429-438 (2009).</li><li>Basma, H., Soto-Guti&#233;rrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Transplantation+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes.">Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).</li><li>Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -. P., Chipperfield, H., Tan, E. -. K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+the+Pancreatic+Endocrine+Lineage.">Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage.</a> Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).</li><li>Kim, S. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+development+is+promoted+by+cyclopamine,+a+Hedgehog+signaling+inhibitor.">Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).</li><li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans:+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus.">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li><li>Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., F&#228;ssler, R., Gu, G., Gerber, H. -. P., Ferrara, N., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vascular+Basement+Membrane:+A+Niche+for+Insulin+Gene+Expression+and+[beta]&gt;+Cell+Proliferation.">The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]&gt; Cell Proliferation.</a> Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).</li><li>Yoshitomi, H., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+interactions+initiate+dorsal+pancreas+development+by+selectively+inducing+the+transcription+factor+Ptf1a.">Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a.</a> Development. 131, 807-817 (2004).</li><li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines.">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li><li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li></ol>

Durante lo sviluppo del pancreas, le cellule pancreatiche di differenziazione sono in stretta vicinanza con le cellule endoteliali della aorta, inoltre, isole pancreatiche sono densamente vascolarizzati per promuovere lo scambio rapido di glucosio nel sangue e ormoni insulari. Dati questi fatti, non è sorprendente che le cellule endoteliali svolgono un ruolo importante nel processo di organogenesi pancreatica. Mentre l&#39;importanza di cellule endoteliali durante lo sviluppo del pancreas è sempre più apprezzato, il ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Concentrazioni </td></tr><tr><td> mTeSR1 (con supplemento) </td><td> Tecnologie di cellule staminali </td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> hESC qualificato matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td> Invitrogen </td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 (Complete) </td><td> VEC Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> A Activin </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC</a> </td><td> 100ng/ml </td></tr><tr><td> Wortmannin </td><td> Invitrogen </td><td> W3144 </td><td> 1 pm </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4116 </td><td> 0.2μM </td></tr><tr><td> Acido all-trans retinoico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2625 </td><td> 2μM </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5942 </td><td> 30 um </td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sodio Selenite </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1882 </td><td> 25 pg / ml </td></tr><tr><td> Transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8158 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td> 10ng/ml </td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> VEC Technologies </td><td> ENDOGRO </td><td> 10mg </td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td> Idrocortisone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0888 </td><td> 1μg/ml </td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td> Macherey Nagel </td><td> 740955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm II sistema di trascrizione inversa </td><td> Promega </td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td> II Brilliant SYBR Green QPCR master mix </td><td> Straragene </td><td> 600548 </td><td></td></tr><tr><td> Sox17 policlonale di capra IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-17355 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Pdx1 policlonale di capra IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-14662 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> C-Peptide policlonale di coniglio </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> 4593 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 asino anti-IgG di coniglio </td><td> Invitrogen </td><td> A-21.206 </td><td> 1/1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 asino anti-IgG di capra </td><td> Invitrogen </td><td> A-21.447 </td><td> 1/1000 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti e kit.

endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell to pancreatic insulin producing cells in a directed differentiation approach

Le cellule staminali embrionali (ESC) hanno due caratteristiche principali: possono essere a tempo indeterminato propagate in vitro in uno stato indifferenziato e sono pluripotenti, avendo così la potenzialità di differenziarsi in diversi lignaggi. Tali proprietà rendono CES estremamente attraente per la terapia cellulare a base e le applicazioni di trattamento di rigenerazione 1. Tuttavia, per il suo pieno potenziale da realizzare le cellule devono essere differenziate in fenotipi maturi e funzionale, che è un compito scoraggiante. Un approccio promettente per indurre la differenziazione cellulare è imitare al cammino dell&#39;organogenesi nell&#39;impostazione in vitro. Sviluppo del pancreas si verifica in 2 fasi specifiche, a cominciare da endoderma, che può svilupparsi in diversi organi, compreso fegato e pancreas. Endoderma induzione può essere ottenuto mediante la modulazione del percorso nodale aggiunta di Activin A 3 in combinazione con diversi fattori di crescita 4-7 </sup&gt;. Cellule endoderma definitive quindi sottoposti impegno pancreatica mediante inibizione di inibizione hedgehog sonic, che può essere ottenuto in vitro mediante l&#39;aggiunta di cyclopamine 8. La maturazione del pancreas è mediata da numerosi eventi collaterali tra cui l&#39;inibizione del segnale di Notch, l&#39;aggregazione di cellule progenitrici del pancreas in 3-dimensionali cluster; induzione di vascolarizzazione, solo per citarne alcuni. Di gran lunga il maggior successo nella maturazione in vitro delle cellule pancreatiche progenitrici derivate CES sono stati raggiunti attraverso l&#39;inibizione del segnale di Notch dal completamento DAPT 9. Malgrado il successo, questo si traduce in bassa resa del fenotipo maturo con funzionalità ridotte. Una zona meno studiato è l&#39;effetto di segnalazione delle cellule endoteliali nella maturazione del pancreas, che è sempre più apprezzato come un fattore importante che contribuisce in in-vivo maturazione di isole pancreatiche 10,11. Il presente studio esamina tale effetto di endothelIAL di segnalazione delle cellule nella maturazione di cellule pancreatiche progenitrici derivate dal Comitato in isole pancreatiche produttrici di insulina come le cellule. Riportiamo un multi-stadio protocollo di differenziazione diretta dove i CES umani vengono prima indotti verso endoderma da Activin A insieme con l&#39;inibizione della via PI3K. Specifica delle cellule del pancreas endoderma si ottiene l&#39;inibizione di sonic hedgehog segnalazione da Cyclopamine insieme con l&#39;induzione dei retinoidi mediante aggiunta di acido retinoico. La fase finale di maturazione viene indotta da segnalazione cellulare endoteliale raggiunti da una co-coltura configurazione. Mentre diverse cellule endoteliali sono stati testati in co-coltura, qui vi presentiamo i nostri dati con le cellule del cuore di ratto endoteliali microvascolari (RHMVEC), principalmente per la facilità di analisi.

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Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Il presente studio descrive un approccio diretto differenziazione nell&#39;indurre la differenziazione pancreatica di cellule staminali embrionali umane. Di grande importanza è la scoperta che cellule endoteliali co-coltura maturazione media di cellule staminali umane embrionali derivano in cellule progenitrici del pancreas di insulina che esprimono.

Delle cellule endoteliali Co-cultura Maturazione media di Cellule Staminali embrionali umane a cellule pancreas che producono insulina in un approccio di differenziazione Regia

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

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