Name: endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell to pancreatic insulin producing cells in a directed differentiation approach
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00
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Reconhecemos o apoio do NIH Innovator Award Nova DP2 116520 e ORAU Ralph Powe Júnior Prêmio Valorização da Faculdade.

1. Manutenção de células <ol><li> HESC H1 (WiCell) foram mantidos em células estaminais embrionárias humanas qualificados Matrigel poços revestidos com mTeSR1 mídia, com os meios de mudar a cada dia. Os poços foram revestidos por solução diluída de matrigel, preparado por adição de 300 ul de matrigel hESC em 25 ml de DMEM: F12. 1 ml desta solução matrigel foi adicionado a cada poço de uma placa de seis bem, ou 400 ul adicionados a cada poço de uma placa de 12 poços e deixou-se revestimento durante 1 ...

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	<li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+:+de+la+transgression+de+l'embryon+humain+&#225;+la+m&#233;decine+r&#233;g&#233;n&#233;ratrice+de+demain.">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain &#225; la m&#233;decine r&#233;g&#233;n&#233;ratrice de demain.</a> Gyn&#233;cologie Obst&#233;trique &#38; Fertilit&#233;. 37, 620-626 (2009).</li><li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+Signals,+and+Lineages+in+Pancreas+Development.">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li><li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li><li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li><li>Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+human+ES+cells+and+iPS+cells+into+mature+pancreatic+insulin-producing+cells.">Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells.</a> Cell Res. 19, 429-438 (2009).</li><li>Basma, H., Soto-Guti&#233;rrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Transplantation+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes.">Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).</li><li>Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -. P., Chipperfield, H., Tan, E. -. K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+the+Pancreatic+Endocrine+Lineage.">Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage.</a> Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).</li><li>Kim, S. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+development+is+promoted+by+cyclopamine,+a+Hedgehog+signaling+inhibitor.">Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).</li><li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans:+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus.">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li><li>Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., F&#228;ssler, R., Gu, G., Gerber, H. -. P., Ferrara, N., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vascular+Basement+Membrane:+A+Niche+for+Insulin+Gene+Expression+and+[beta]&gt;+Cell+Proliferation.">The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]&gt; Cell Proliferation.</a> Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).</li><li>Yoshitomi, H., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+interactions+initiate+dorsal+pancreas+development+by+selectively+inducing+the+transcription+factor+Ptf1a.">Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a.</a> Development. 131, 807-817 (2004).</li><li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines.">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li><li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li></ol>

Durante o desenvolvimento de pâncreas, células pancreáticas de diferenciação estão em estreita proximidade com as células endoteliais da aorta, além disso, ilhéus pancreáticos são densamente vascularizado para promover a troca rápida de glicose no sangue e hormonas de ilhéus. Tendo em conta estes factos, não é surpreendente que as células endoteliais desempenham um papel importante no processo de organogénese pancreático. Embora a importância das células endoteliais durante o desenvolvimento pancreá...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Concentrações </td></tr><tr><td> mTeSR1 (com suplemento) </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> hESC matrigel qualificado </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td> Invitrogen </td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 (Completo) </td><td> VEC Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Activina A </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC</a> </td><td> 100ng/ml </td></tr><tr><td> Wortmannin </td><td> Invitrogen </td><td> W3144 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4116 </td><td> 0.2μM </td></tr><tr><td> All-trans retinóico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2625 </td><td> 2μM </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5942 </td><td> 30μM </td></tr><tr><td> Nicotinamida </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Selenito de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1882 </td><td> 25 ug / ml </td></tr><tr><td> Transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8158 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td> 10ng/ml </td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> VEC Technologies </td><td> ENDOGRO </td><td> 10mg </td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td> Hidrocortisona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0888 </td><td> 1μg/ml </td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td> Macherey Nagel </td><td> 740955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm II sistema de transcrição reversa </td><td> Promega </td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td> Brilhante II SYBR Green QPCR mestre mix </td><td> Straragene </td><td> 600548 </td><td></td></tr><tr><td> Sox17 IgG de cabra policlonal </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-17.355 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> PDX1 cabra policlonal IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-14.662 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> C-Peptide policlonal de coelho </td><td> Sinalização celular </td><td> 4593 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 burro anti-IgG de coelho </td><td> Invitrogen </td><td> A-21.206 </td><td> 1/1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 cabra burro anti-IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-21.447 </td><td> 1/1000 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes e kits.

endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell to pancreatic insulin producing cells in a directed differentiation approach

Células-tronco embrionárias (ESC) tem duas características principais: eles podem ser propagadas in vitro indefinidamente em um estado indiferenciado e são pluripotentes, tendo assim o potencial de se diferenciar em várias linhagens. Essas propriedades fazem CES extremamente atraente para a terapia baseada em células e aplicações de tratamento regenerativo 1. No entanto, para o seu pleno potencial a ser realizado as células têm de ser diferenciada em fenótipos maduros e funcionais, o que é uma tarefa assustadora. Uma abordagem promissora na indução da diferenciação celular é a de perto imitar o caminho de organogénese na configuração in vitro. Desenvolvimento pancreática é conhecido para ocorrer em fases específicas 2, começando com endoderme, que pode desenvolver em vários órgãos, incluindo fígado e pâncreas. Indução endoderme pode ser conseguido por modulação da via nodal através da adição de Activina A 3 em combinação com vários factores de crescimento de 4-7 </sup&gt;. Células endoderme definitivos, em seguida, submetidos a compromisso pancreática por inibição da sónica inibição hedgehog, que pode ser conseguida in vitro por adição de ciclopamina 8. Maturação pancreática é mediada por vários eventos paralelos, incluindo inibição da sinalização do entalhe; agregação de células progenitoras pancreáticas em 3-dimensionais aglomerados; indução da vascularização; para nomear alguns. De longe o mais bem sucedido na maturação in vitro de células progenitoras derivadas do CES pancreáticas foram alcançados através da inibição da sinalização Notch por DAPT suplementação 9. Embora bem sucedido, isto resulta em baixo rendimento do fenótipo maduro com funcionalidade reduzida. A área menos estudada é o efeito de células endoteliais de sinalização na maturação do pâncreas, que é cada vez mais apreciada como um fator importante que contribui para in-vivo ilhota pancreática maturação 10,11. O presente estudo explora o efeito de endothelial célula de sinalização na maturação de células progenitoras humanas CES derivados pancreáticas produtoras de insulina em ilhota células semelhantes. Relatamos um multi-estágio protocolo diferenciação dirigida para onde os CES humanos são primeiro induzida no sentido endoderme por Activina A, juntamente com a inibição da via PI3K. Especificação do pâncreas de células endoderme é conseguido através da inibição da sinalização por Sonic hedgehog ciclopamina juntamente com a indução de retinóide por adição de ácido retinóico. A fase final de maturação é induzida pela sinalização celular endotelial conseguido através de uma configuração de co-cultura. Embora várias células endoteliais foram testados na co-cultura, aqui apresentamos os nossos dados com células de rato do coração microvasculares endoteliais (RHMVEC), principalmente para a facilidade de análise.

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Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

O presente estudo descreve uma abordagem diferenciada dirigida em induzir a diferenciação de pâncreas de células estaminais embrionárias humanas. De grande importância é a constatação de que células endoteliais co-cultura maturação media de células-tronco embrionárias humanas derivadas progenitores pâncreas em células que expressam insulina.

Células endoteliais em co-cultura Maturação media de células estaminais humanas embrionárias a células pancreáticas produtoras de insulina em uma abordagem diferenciada Direção

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biologia

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Embrionárias com células-tronco derivadas de células endoteliais para tratamento da isquemia dos membros posteriores

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...