Name: isolation of mammary epithelial cells from three-dimensional mixed-cell spheroid co-culture
Uploaded: 2012-04-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture at JoVE.com

1. Etablering Tredimensjonale Co, kulturer <ol><li> Dagen før etablere de øvrige kulturer, fjerne Matrigel fra fryseren og tine på is i en 4 ° C kjøleskap over natten. </li><li> På dagen for forsøket, forberede medium for co-kulturen, som tilsvarer medium for epitelceller som skal brukes (HMEC medium i dette eksemplet: DME/F12 medium med 10% bovint kalveserum, 5 mikrogram / ml Insulin , 1 mikrogram / ml hydrokortison, og 1 ng / ml EGF). Holde mediet på is i minst 1 time forut for blanding med Matrigel. </li><l...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100, 57-70 (2000).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology.">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).</li><li>Li, H., Fan, X., Houghton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment:+the+role+of+the+tumor+stroma+in+cancer.">Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer.</a> J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).</li><li>Tse, J. C., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+metastasis:+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+contribution+of+tumor+microenvironment.">Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment.</a> J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).</li><li>Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+signaling+in+fibroblasts+modulates+the+oncogenic+potential+of+adjacent+epithelia.">TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia.</a> Science. 303, 848-851 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-stroma+interactions.">Tumor-stroma interactions.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 15, 97-101 (2005).</li><li>Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+optimization+of+an+organotypic+assay+system+that+imitates+human+hair+follicle-like+epithelial-mesenchymal+interactions.">Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions.</a> Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).</li><li>Kilani, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cytotoxicity+of+gemcitabine+in+bladder+cancer+cell+lines.">Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines.</a> Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).</li><li>Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fibroblast-tumor+cell+interaction+causes+downregulation+of+RACK1+mRNA+expression+in+breast+cancer+cells+in+vitro.">Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro.</a> Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).</li><li>Silzle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+fibroblasts+recruit+blood+monocytes+into+tumor+tissue.">Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue.</a> Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).</li><li>Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+stimulus+of+lung+fibroblasts+on+lung+cancer+cells+is+impaired+by+the+receptor+for+advanced+glycation+end-products.">Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).</li><li>Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+fibroblasts+to+regulate+the+formation+of+three-dimensional+vessel-like+structures+from+endothelial+cells+in+vitro.">Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).</li><li>Liu, T., Lin, B., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+promoted+tumor+spheroid+invasion+on+a+microfluidic+3D+co-culture+device.">Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device.</a> Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).</li><li>Zengel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+therapy+for+synergic+inhibition+of+tumour+cell+invasion+and+tumour-induced+angiogenesis.">Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis.</a> BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterologous+3-D+coculture+model+of+breast+tumor+cells+and+fibroblasts+to+study+tumor-associated+fibroblast+differentiation.">A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation.</a> Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+spheroids+maintained+in+suspension.">Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension.</a> Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).</li><li>Hirschhaeuser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li><li>Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexpression+of+the+TJ+protein+CLDN1+induces+apoptosis+in+breast+tumor+spheroids.">Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids.</a> Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).</li><li>Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D,+tamoxifen+and+beta-estradiol+modulate+breast+cancer+cell+growth+and+interleukin-6+and+metalloproteinase-2+production+in+three-dimensional+co-cultures+of+tumor+cell+spheroids+with+endothelium.">Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium.</a> Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).</li><li>Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fibroblast+Tiam1+in+tumor+cell+invasion+and+metastasis.">The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis.</a> Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).</li></ol>

Metoden som presenteres her er en enkel tilnærming til å analysere effektene av stromale fibroblaster på epiteliale celler, inkludert tumor celler. Det tillater for direkte celle-celle interaksjon innenfor en tre-dimensjonal sammenheng som støttes av ekstracellulær basalmembran matrix, samtidig som enkel ekstraksjon av celler fra matrix for videre analyse. Dette kan brukes til studier av tumor-assosierte stroma, som fibroblast linjer kan bli manipulert til å påvirke signalveiene av valg og epiteliale linjer kan v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> BD Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356237 </td><td> Phenol-rød fri </td></tr><tr><td> Hyclone Klassisk flytende medium: DMEM F12 </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone Bovine kalveserum </td><td> ThermoScientific </td><td> SH3007303 </td><td></td></tr><tr><td> Insulin </td><td> EMD Kjemikalier </td><td> 407709 </td><td> Løs opp i 0.005N HCl; 0,22 mM filter </td></tr><tr><td> Hydrokortison </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4001 </td><td> Løs opp i 50% EtOH; 0,22 mM filter </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9644 </td><td> Løs opp i 10mm eddiksyre; 0,22 mM filter </td></tr></tbody></table>

isolation of mammary epithelial cells from three-dimensional mixed-cell spheroid co-culture

Mens enorme innsatsen har gått inn i å identifisere signalveier og molekyler involvert i normale og maligne celle oppførsel 1-2, mye av dette arbeidet har blitt utført ved hjelp av klassiske to-dimensjonale cellekultur modeller, som gir mulighet for enkel celle manipulering. Det har blitt klart at intracellulære signalveier er påvirket av ekstracellulære styrker, inkludert dimensjonalitet og celle overflatespenning 3-4. Flere tilnærminger har blitt tatt for å utvikle tredimensjonale modeller som mer nøyaktig representere biologisk vevet arkitektur tre. Selv om disse modellene innlemme multi-dimensjonalitet og arkitektoniske påkjenninger, er studiet av påfølgende effekter på cellene mindre lettvinte enn i to-dimensjonal vevskultur grunn av begrensninger på modeller og vanskeligheten med å trekke ut celler for senere analyse. Den viktige rolle mikromiljøet rundt svulster i tumorigenesis og tumor atferd is stadig anerkjent 4. Tumor stroma er sammensatt av flere celletyper og ekstracellulære molekyler. Under tumorutviklingen det er toveis signalene mellom tumorceller og stromale celler 5. Selv om noen faktorer som deltar i tumor-stroma co-evolusjon har blitt identifisert, er det fortsatt behov for å utvikle enkle teknikker for å systematisk identifisere og studere hel rekke av disse signalene 6. Fibroblaster er den mest tallrike celletype i normal eller tumor-assosierte stromale vev, og bidra til deponering og vedlikehold av basalmembran og parakrine vekstfaktorer syv. Mange grupper har brukt tre dimensjonale kultur systemer for å studere rollen fibroblaster på ulike cellulære funksjoner, deriblant tumor respons på behandling, rekruttering av immunceller, signalmolekyler, spredning, apoptose, angiogenese, og invasjon 8-15. Vi har optimalisert en enkel metode for assEssing effekten av brystkjertlene fibroblaster på mammary epitelceller ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig ekstracellulær matriks modell for å lage tre-dimensjonale kulturer blandede celle populasjoner (co-kulturer) 16-22. Med fortsatt co-kulturen cellene danner spheroids med fibroblaster clustering i interiør og epitelceller i hovedsak på utsiden av spheroids og forming flercellede anslag inn i matrisen. Manipulering av fibroblaster som fører til endrede epitelial celle invasivitet lett kan kvantifiseres av endringer i tall og lengde av epitelial anslag 23. Videre har vi utviklet en metode til å isolere epitelceller av tre-dimensjonal co-kulturen som forenkler analyse av virkningene av fibroblast eksponering på epitelial oppførsel. Vi har funnet at effekten av co-kultur vedvare i uker etter epitelial celle isolasjon, tillater god tid for å utføre flere analyser. Denne metoden er tilpasningsdyktige til cellenevarierende malignt potensial og trenger ingen spesialisert utstyr. Denne teknikken gjør det mulig for hurtig evaluering av in vitro Cellemodeller under flere forhold, og de ​​tilsvarende resultatene kan sammenlignes med in vivo animalsk vev modeller så vel som menneskelige vevsprøver.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture at JoVE.com

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

En enkel metode er beskrevet for å analysere effekter av vev fibroblaster på tilknyttede epitelceller. Kombinasjonen av denne metoden og tre-dimensjonale vevskultur kan lette analysen av cellene etter isolasjon fra 3D. Teknikken er aktuelt å celler med varierende malignt potensial, slik systematisk studie av effekten av tumor-assosierte stroma på kreftcellene.

Isolering av brystkjertelen Epitelceller fra Tredimensjonal Mikset celle Spheroid Co, kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Et analytisk verktøy som kvantifiserer Cellular Morfologi Endringer fra Tredimensjonal fluorescens bilder

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolasjon og kultur av Dental Epiteliale stamceller fra voksne musen Fortann

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensjonal Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Evaluering av angiogenetiske egenskaper av stamceller for eggstokkreft ved hjelp av det tredimensjonale kokultursystemet, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...