Name: transflp &#x2014; a method to genetically modify vibrio cholerae based on natural transformation and flp-recombination
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TransFLP â€” A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination Video at JoVE.com

وأود أن أنوه أولغا سيلفا دي سوزا للحصول على المساعدة الفنية. وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم السويسري (SNSF) منحة 31003A_127029.

ويتمثل الأسلوب TransFLP (الشكل 1) من ثلاثة مناهج مختلفة: I) حذف اثنين من الجينات المجاورة ترميز المحددات الفوعة من V. الكوليرا (على سبيل المثال، ΔctxAB)؛ II) إزالة جزيرة المرضية (مثل ΔVPI-1)، وIII) إدماج بوليميراز RNA T7 التي تعتمد على تسلسل المروج المنبع من الجينات ا...

<ol>
	<li>Miller, V. L., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+suicide+vector+and+its+use+in+construction+of+insertion+mutations:+osmoregulation+of+outer+membrane+proteins+and+virulence+determinants+in+Vibrio+cholerae+requires+toxR.">A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR.</a> J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).</li><li>Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+disrupting+genes+in+the+Escherichia+coli+genome.">A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).</li><li>Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+an+eae+deletion+mutant+of+enteropathogenic+Escherichia+coli+by+using+a+positive-selection+suicide+vector.">Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector.</a> Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).</li><li>De Souza Silva, O., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+Vibrio+cholerae+by+combining+natural+transformation+with+FLP+recombination.">Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination.</a> Plasmid. 64, 186-195 (2010).</li><li>Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae.">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310, 1824-1827 (2005).</li><li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY.">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).</li><li>Marvig, R. L., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+cholerae+as+a+tool-optimizing+the+procedure.">Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure.</a> BMC Microbiol. 10, 155 (2010).</li><li>Blokesch, M., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serogroup+Conversion+of+Vibrio+cholerae+in+Aquatic+Reservoirs.">Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs.</a> PLoS Pathog. 3, e81 (2007).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158, 9-14 (1995).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. 1, (1989).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells.">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133, 90-102 (2008).</li><li>Karaolis, D. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vibrio+cholerae+pathogenicity+island+associated+with+epidemic+and+pandemic+strains.">A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).</li><li>Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+promoter+contacts+essential+for+promoter+activity+in+vivo.">T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).</li><li>Pan, S. H., Malcolm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+background+expression+and+improved+plasmid+stability+with+pET+vectors+in+BL21+(DE3).">Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3).</a> Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).</li><li>Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani, M., Kamruzzaman, J. J., Mekalanos, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+diverse+toxin-coregulated+pilus-positive+Vibrio+cholerae+strains+fails+to+demonstrate+evidence+for+Vibrio+pathogenicity+island+phage.">Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage.</a> Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).</li><li>Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+diversity+of+quorum-sensing+systems+in+clinical+and+environmental+isolates+of+Vibrio+cholerae.">Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae.</a> Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).</li><li>Heidelberg, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+of+both+chromosomes+of+the+cholera+pathogen+Vibrio+cholerae.">DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae.</a> Nature. 406, 477-483 (2000).</li></ol>

وصف طريقة TransFLP أعلاه وغيرها وقد تم على نطاق واسع 5 المستخدمة في مختبرنا. هذا النوع من التلاعب الجيني التي هي ممكنة، ضمن جملة أمور: حذف الجينات واحد ومجموعات الجينات، حذف الجزر الجيني (على سبيل المثال، VPI-1)، إدراج تسلسل المنبع من الجين في المصالح (على سبي...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> كيتين رقائق </td><td> سيجما </td><td> C9213 </td><td> التعقيم المطلوبة </td></tr><tr><td> OPTIONAL: Micropulser (في حال وينبغي رفعه من قبل المضادات الحيوية كاسيت recombinase FLP المشفرة على PBR-FLP) </td><td> Biorad </td><td> 165-2100 </td><td> أو قابلة للمقارنة electroporators </td></tr></tbody></table>

transflp &#x2014; a method to genetically modify vibrio cholerae based on natural transformation and flp-recombination

تتوفر العديد من الطرق لمعالجة الكروموسومات البكتيرية 1-3. معظم هذه البروتوكولات تعتمد على إدخال البلازميدات تنسخي مشروط (مثل إيواء replicons البير التي تعتمد على درجة الحرارة أو تراعي 1،2). يتم دمج هذه البلازميدات البكتيرية في الكروموسومات تقوم على التماثل بوساطة إعادة التركيب. وغالبا ما تكون مثل هذه المسوخ غرزي استخدامها مباشرة في إعدادات التجريبية. وبدلا من ذلك، يمكن إجراء الختان لاختيار البلازميد تليها خسارتها، والتي لالجراثيم سلبية الغرام تعتمد في أغلب الأحيان على انزيم مكافحة اختيار سكراز ليفان المشفرة بواسطة الجينات هيئة تنسيق المعونة 4. يمكن للالختان إما استعادة النمط الجيني ما قبل الإدراج أو تؤدي إلى تبادل بين كروموسوم ونسخة بلازميد ترميز الجين المعدلة. عيوب هذا الأسلوب هو أنه يستغرق وقتا طويلا. البلازميد لابد من استنساخ الأولى؛ أنه يتطلب نقل الأفقي إلى V. الكوليرا (ن معظم<html> otably من التزاوج مع E. سلالة الإشريكية المانحة) أو التحول الاصطناعي لهذه الأخيرة؛ واستئصال البلازميد هو عشوائي ويمكن إما استعادة النمط الجيني الأولي أو إنشاء التعديل المطلوب إذا لم يمارس اختيار إيجابية. هنا، نقدم طريقة للتلاعب السريع للV. الكوليرا كروموسوم (ق) 5 (الشكل 1). ويستند هذا الأسلوب على تحريض TransFLP كيتين بوساطة اكتشفت مؤخرا من الكفاءة الطبيعية في هذا الحي ممثل 6 و أخرى من جنس الضمة مثل V. fischeri 7. الكفاءة الطبيعية يسمح للامتصاص الحمض النووي DNA مجانا بما في ذلك شظايا ولدت PCR. تؤخذ مرة واحدة حتى، ويعيد توحيد DNA مع كروموسوم معين وجود ما لا يقل عن 250-500 من بي بي المرافقة مثلي المنطقة 8. منها علامة الاختيار في الفترات الفاصلة بين هذه المناطق المحيطة يسمح الكشف سهولة transformants التي تحدث في كثير من الأحيان. ر &quot;&gt; ويمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجات وراثية مختلفة من الكوليرا V. وربما غيرها أيضا البكتيريا المختصة بشكل طبيعي. نحن نقدم أمثلة ثلاثة على رواية ما يمكن تحقيقه باستخدام هذا الأسلوب بالإضافة إلى دراستنا المنشورة سابقا على الحذف جين واحد وعلى إضافة علامة تقارب-متواليات 5. يتم دمج عدة خطوات التحسين بشأن بروتوكول الأولي من الكيتين التي يسببها التحول الطبيعي 6 في هذا البروتوكول TransFLP. وتشمل هذه وغيرها استبدال شظايا قذيفة السلطعون من رقائق كيتين المتاحة تجاريا 8، على التبرع PCR المستمدة من الحمض النووي وتحويل المواد 9، وإضافة المواقع المستهدفة FLP-إعادة التركيب (FRT) 5. مواقع FRT يسمح الختان الموقع موجه للعلامة الاختيار بوساطة recombinase FLP 10.

وتظهر نتائج ممثل في الأمثلة الثلاثة أرقام 4 إلى 6. النهج الأول يهدف إلى حذف الجينات المجاورة ctxA وctxB. معا ترميز عامل الفوعة الرئيسية للV. الكوليرا، بكتيريا الكوليرا. قمنا بتصميم [أليغنوكليوتيد] للأسلوب TransFLP كما هو موضح أعلاه وفقا للالشكل 3. سل...

Watch this Scientific Journal Video about TransFLP â€” A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination Video at JoVE.com

TransFLP â€” A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination Video (Video) | JoVE

وهناك طريقة سريعة لتعديل جينوم<em&gt; V. الكوليرا</emيوصف&gt;. وتشمل هذه التعديلات حذف الجينات واحد، مجموعات الجينات والجزر الجيني وكذلك التكامل من متواليات قصيرة (على سبيل المثال عناصر المروج أو تسلسل النسب، علامة). وتستند هذه الطريقة على التحول الطبيعي وإعادة التركيب FLP.

TransFLP - طريقة لتعديل وراثيا<em&gt; ضمة الكوليرا</em&gt; بناء على التحول الطبيعي وإعادة التركيب، FLP

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line Video (Video) | JoVE

A الفحص الإنقاذ والتحول لفحص مضاد الليشمانيات الطفيلي داخل الخلايا ضد<em&gt; الليشمانيا الدونوفانية</em&gt; Amastigotes في THP1 الحادة اللوكيميا الإنسان الوحيدات الخط الخليوي

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood Video (Video) | JoVE

السريرية تطبيق<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer Video (Video) | JoVE

فائقة الدقة التصوير من الخلايا القاتلة الطبيعية المناعية المشبك على دعم الزجاج مستو الدهن طبقة ثنائية

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen Video (Video) | JoVE

والطريقة الأمثل لعزل وتوسيع قسما ثابتا الطبيعية الخلايا التائية القاتلة من الماوس الطحال

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells Video (Video) | JoVE

تنفيذ نظام العدوى أساس إدراج-نافذ غشاء لدراسة آثار يفرز البكتيرية السموم على خلايا المضيف الثدييات

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species Video (Video) | JoVE

تطوير أكثر حساسية وخصوصية اللونية آجار المتوسطة للكشف عن<em&gt; الضمة نظيرة الحالة للدم</em&gt; وغيره<em&gt; الضمة</em&gt; الأنواع

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries Video (Video) | JoVE

ومنصة للفحوصات مكافحة بيوفيلم مناسبة لاستكشاف المكتبات مركب طبيعي

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals Video (Video) | JoVE

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates Video (Video) | JoVE

تقنيات المختبر تستخدم للحفاظ على والتمايز بيوتيبس<em&gt; ضمة الكوليرا</em&gt; العوازل السريرية والبيئية

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro Video (Video) | JoVE

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...