Name: transflp &#x2014; a method to genetically modify vibrio cholerae based on natural transformation and flp-recombination
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00
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私は、技術支援のためのオルガ·デ·ソウザ·シルバを承認したいと思います。この作品は、スイス国立科学財団（SNSF）グラント31003A_127029によってサポートされていました。

TransFLP法（ 図1）は、3つの異なるアプローチが例示される：I）Vの病原性決定因子をコードする2つの隣接した遺伝子の欠失コレラ菌 （ 例えば 、ΔctxAB）、病原性島のⅡ）除去（ 例えば 、ΔVPI-1）、およびその後にそのを可能にする目的遺伝子の上流にT7 RNAポリメラーゼ依存性のプロモーター配列のIII）の統合それぞれのひずみ背景に人工的な発現（ <em...

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	<li>Miller, V. L., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+suicide+vector+and+its+use+in+construction+of+insertion+mutations:+osmoregulation+of+outer+membrane+proteins+and+virulence+determinants+in+Vibrio+cholerae+requires+toxR.">A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR.</a> J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).</li><li>Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+disrupting+genes+in+the+Escherichia+coli+genome.">A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).</li><li>Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+an+eae+deletion+mutant+of+enteropathogenic+Escherichia+coli+by+using+a+positive-selection+suicide+vector.">Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector.</a> Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).</li><li>De Souza Silva, O., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+Vibrio+cholerae+by+combining+natural+transformation+with+FLP+recombination.">Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination.</a> Plasmid. 64, 186-195 (2010).</li><li>Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae.">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310, 1824-1827 (2005).</li><li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY.">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).</li><li>Marvig, R. L., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+cholerae+as+a+tool-optimizing+the+procedure.">Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure.</a> BMC Microbiol. 10, 155 (2010).</li><li>Blokesch, M., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serogroup+Conversion+of+Vibrio+cholerae+in+Aquatic+Reservoirs.">Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs.</a> PLoS Pathog. 3, e81 (2007).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158, 9-14 (1995).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. 1, (1989).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells.">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133, 90-102 (2008).</li><li>Karaolis, D. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vibrio+cholerae+pathogenicity+island+associated+with+epidemic+and+pandemic+strains.">A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).</li><li>Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+promoter+contacts+essential+for+promoter+activity+in+vivo.">T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).</li><li>Pan, S. H., Malcolm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+background+expression+and+improved+plasmid+stability+with+pET+vectors+in+BL21+(DE3).">Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3).</a> Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).</li><li>Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani, M., Kamruzzaman, J. J., Mekalanos, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+diverse+toxin-coregulated+pilus-positive+Vibrio+cholerae+strains+fails+to+demonstrate+evidence+for+Vibrio+pathogenicity+island+phage.">Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage.</a> Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).</li><li>Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+diversity+of+quorum-sensing+systems+in+clinical+and+environmental+isolates+of+Vibrio+cholerae.">Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae.</a> Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).</li><li>Heidelberg, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+of+both+chromosomes+of+the+cholera+pathogen+Vibrio+cholerae.">DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae.</a> Nature. 406, 477-483 (2000).</li></ol>

TransFLP方法は、上述の他の場所と5は広く、我々の研究室で使われてきました。実現可能である遺伝子操作の種類は、とりわけ以下のとおり、単一の遺伝子や遺伝子群の欠失、ゲノムの島々の欠失（ 例えば 、VPI-1）は、目的の遺伝子の上流配列の挿入（ 例えば 、プロモーター配列）と挿入を特定の遺伝子（ 例えば 、符号化アフィニティータグ）の末尾のシーケ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>キチンフレーク</td><td>シグマ</td><td> C9213 </td><td>必要なオートクレーブ</td></tr><tr><td>オプション：Micropulser場合（抗生物質カセットはPBR-FLP上にエンコードFlpリコンビナーゼによって切除されるべきである） </td><td>バイオラッド</td><td> 165-2100 </td><td>または同等のエレクトロポ</td></tr></tbody></table>

transflp &#x2014; a method to genetically modify vibrio cholerae based on natural transformation and flp-recombination

いくつかの方法は1-3細菌の染色体を操作することが可能です。これらのプロトコルの大部分は、条件付きで複製プラスミドの挿入（1,2 PIR依存または温度感受性レプリコンを宿すなど ）に依存しています。これらのプラスミドは、相同性媒介組換えに基づく細菌染色体に組み込まれています。このような挿入変異体はしばしば直接実験の設定に使用されています。あるいはまた、その損失が続くプラスミド切除の選択はしばしばsacB遺伝子4でエンコードされたカウンターで選択レバンスクラーゼの酵素に依存しているグラム陰性細菌に、これを行うことができます。切除は、事前挿入遺伝子型または染色体と改変された遺伝子のプラスミドにコードされたコピーの間の交流の結果を復元することができます。この手法の欠点は、時間がかかるということです。プラスミドは、最初にクローンする必要があり、それは Vへの水平転送を必要とするコレラ菌 （最大n<html> otably E.との交配によって大腸菌ドナー株）または後者の人工変換、およびプラスミドの切除は、ランダムであり、どちらかの初期遺伝子型を復元するか、正の選択が発揮されていない場合、必要な変更を作成することができます。ここでは、Vの迅速な操作のための方法を提示するコレラ菌染色体（S）5（ 図1）。このTransFLP法はこの生物6、などVのビブリオ属の他の代表の天然能力の最近発見されたキチン質を介した誘導に基づくシャリ 7。自然な能力は、PCRによって生成されたDNA断片を含む自由なDNAの取り込みを可能にします。一度取り上げ、染色体とDNAの再結合は、相同領域8に隣接するの250から500 bpの最小値の存在を与えられた。これらの隣接領域の中間の選択マーカーを含めることは頻繁に発生した形質転換体を容易に検出することができます。 tは&quot;&gt;このメソッドはコレラ菌の異なる遺伝子操作のために使用され、潜在的にも他の天然有能なバクテリアすることができます我々は、以前に公開された単一遺伝子欠失の研究とに加えて、この方法によって達成することができるものに3小説の例を提供アフィニティータグ配列5。キチン誘発自然変換6の初期のプロトコルに関しては、いくつかの最適化のステップはこのTransFLPプロトコルに組み込まれているのに加え、これらは他の市販のキチンフレーク8、PCRの寄付によってカニ殻断片の交換中に含める由来の材料9の変換など、DNA、およびFLP組換え標的部位の付加（FRT）5。FRT部位は、FLPリコンビナーゼ10によって媒介される選択マーカーの部位特異的切除を可能にします。

3例の代表的な結果を6〜図4に示されている。隣接する遺伝子ctxAとctxBを削除することを目的と最初のアプローチ。彼らは一緒にVの主要な病原因子をエンコードするコレラ菌 、コレラ毒素。我々は、上記のようにTransFLPメソッドのオリゴヌクレオチドを設計し、 図3を参照に記載の方法。親株は、ctxABの元のDNA遺伝子座のFRT-挟ま...

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のゲノムを変更するための簡単​​な方法<em&gt; V。コレラ</em&gt;記載されている。これらの変更は、単一の遺伝子、遺伝子クラスターおよびゲノムの島だけでなく、短い配列（例えばプロモーターエレメントまたはアフィニティータグ配列）の統合の削除があります。方法は自然形質転換およびFLP組換えに基づいています。

TransFLP - 遺伝的に変更する方法<em&gt;コレラ菌</em&gt;自然形質転換およびFLP組換えに基づき

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Research

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