Name: transflp &#x2014; a method to genetically modify vibrio cholerae based on natural transformation and flp-recombination
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00
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나는 기술 지원을 위해 올가 드 수자 실바을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (SNSF) 부여 31003A_127029에 의해 지원되었다.

TransFLP 방법 (그림 1)은 세 가지 다른 방법으로 예시되어 있습니다 : I) V.의 독성의 determinants를 인코딩 두 개의 인접한 유전자의 삭제 cholerae (예를 들어, ΔctxAB), II) pathogenicity 섬 (예 : ΔVPI-1)의 제거 및 III) T7 RNA의 효소에 의존 발기인 시퀀스의 통합은 업스트림 유전자 수준의 관심, 이후 수의 각각의 변형을 배경으로 인공 표현 (예를 들어, T7-tfoX) (그림 2)...

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	<li>Miller, V. L., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+suicide+vector+and+its+use+in+construction+of+insertion+mutations:+osmoregulation+of+outer+membrane+proteins+and+virulence+determinants+in+Vibrio+cholerae+requires+toxR.">A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR.</a> J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).</li><li>Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+disrupting+genes+in+the+Escherichia+coli+genome.">A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).</li><li>Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+an+eae+deletion+mutant+of+enteropathogenic+Escherichia+coli+by+using+a+positive-selection+suicide+vector.">Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector.</a> Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).</li><li>De Souza Silva, O., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+Vibrio+cholerae+by+combining+natural+transformation+with+FLP+recombination.">Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination.</a> Plasmid. 64, 186-195 (2010).</li><li>Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae.">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310, 1824-1827 (2005).</li><li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY.">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).</li><li>Marvig, R. L., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+cholerae+as+a+tool-optimizing+the+procedure.">Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure.</a> BMC Microbiol. 10, 155 (2010).</li><li>Blokesch, M., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serogroup+Conversion+of+Vibrio+cholerae+in+Aquatic+Reservoirs.">Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs.</a> PLoS Pathog. 3, e81 (2007).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158, 9-14 (1995).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. 1, (1989).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells.">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133, 90-102 (2008).</li><li>Karaolis, D. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vibrio+cholerae+pathogenicity+island+associated+with+epidemic+and+pandemic+strains.">A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).</li><li>Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+promoter+contacts+essential+for+promoter+activity+in+vivo.">T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).</li><li>Pan, S. H., Malcolm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+background+expression+and+improved+plasmid+stability+with+pET+vectors+in+BL21+(DE3).">Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3).</a> Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).</li><li>Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani, M., Kamruzzaman, J. J., Mekalanos, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+diverse+toxin-coregulated+pilus-positive+Vibrio+cholerae+strains+fails+to+demonstrate+evidence+for+Vibrio+pathogenicity+island+phage.">Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage.</a> Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).</li><li>Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+diversity+of+quorum-sensing+systems+in+clinical+and+environmental+isolates+of+Vibrio+cholerae.">Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae.</a> Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).</li><li>Heidelberg, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+of+both+chromosomes+of+the+cholera+pathogen+Vibrio+cholerae.">DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae.</a> Nature. 406, 477-483 (2000).</li></ol>

TransFLP 방법은 5 광범위하게 저희 연구실에서 사용 된 이상, 다른 곳에서 설명했다. 가능한 아르 유전자 조작의 종류는 다른 이들과 같습니다 : 하나의 유전자 및 유전자 클러스터의 삭제, 게놈 섬의 삭제 (예 : VPI-1) 관심 유전자 (예를 들어, 발기인 시퀀스)의 상류 시퀀스의 삽입과 삽입을 특정 유전자 (예를 들어, 인코딩 연관성 태그)의 끝 부분에 시퀀스. <p class="jove_...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 키틴 조각 </td><td> 시그마 </td><td> C9213 </td><td> 필요 Autoclaving </td></tr><tr><td> 선택 사항 : Micropulser (경우에 항생제 카세트는 PBR-flp에 인코딩 Flp의 recombinase에 의해 excised 수 있습니다) </td><td> Biorad </td><td> 165-2100 </td><td> 또는 비교 electroporators </td></tr></tbody></table>

transflp &#x2014; a method to genetically modify vibrio cholerae based on natural transformation and flp-recombination

몇 가지 방법이 박테리아 염색체 1-3 조작 할 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 대부분은 (예 : PIR에 따라 달라 나 온도에 민감한 replicons에게 1,2을 품고) 조건 replicative의 plasmids의 삽입에 의존하고 있습니다. 이러한 plasmids은 호몰 로지로 인한 재조합에 따라 세균​​ 염색체에 통합되어 있습니다. 이러한 insertional 돌연변이는 종종 직접 실험 설정에 사용됩니다. 또는 손실에 이어 플라스미드 절단에 대한 선택은 종종 sacB 유전자 넷으로 인코딩 된 카운터 선택 레반의 sucrase 효소에 의존 그람 음성 박테리아있는 수행 할 수 있습니다. 절단 중 하나 미리 삽입 유전자형 또는 염색체와 수정 된 유전자의 플라스미드 인코딩 복사본 사이의 교류의 결과를 복원 할 수 있습니다. 이 기법의 단점은 시간이 많이 걸리는 점입니다. 플라스미드는 먼저 복제 할 수 있습니다, 그것은 V.으로 수평 이동이 필요합니다 cholerae (대부분 N<html> otably E.와 결합하여 대장균의 기증 부담) 또는 후자의 인공 변환 및 플라스미드의 절단은 임의입니다하거나 초기 유전자형을 복원하거나 더 긍정적 인 선택이 가해되지 않을 경우 원하는 수정을 만들 수 있습니다. 여기, 우리는 V.의 빠른 조작하기위한 방법을 제시 cholerae의 염색체 (들) 5 (그림 1). 이 TransFLP 방법은 같은 V.으로 속 장염의 유기체 6 다른 대표의 자연 능력의 최근에 발견 된 키틴로 인한 유도를 기반으로 fischeri 7. 자연 능력은 PCR 생성 된 DNA 조각을 포함한 무료 DNA의 이해 할 수 있습니다. 일단 차지하고, DNA가 일치하는 지역 8 측면을 노릴의 250-500 BP의 최소의 존재 주어진 염색체와 recombines. 이러한 측면을 노릴 지역에서 중간 선택 마커를 포함하면 자주 발생 transformants을 쉽게 감지 할 수 있습니다. t는 &quot;&gt;이 방법은 V. cholerae의 다른 유전자 조작에 사용되며 잠재적으로 다른 자연적 능력이 박테리아 할 수 있습니다. 우리는 이전에 다음 ID로 출판 단일 유전자 삭제에 대한 연구와에 추가이 방법에 의해 수행 될 수있는 세 개 소설 예제를 제공합니다 연관성 태그 시퀀스 5 추가가. 키틴 유발 자연 변화 6의 초기 프로토콜에 관한 몇 가지 최적화 단계는이 TransFLP 프로토콜에 통합되어 있습니다.이 다른 사람들 사이에 상업적으로 이용 가능한 키틴 조각 8, PCR의 기부에 의한 게 껍질 조각의 교체를 포함 자료 9, FLP - 재결합 대상 사이트 (FRT) 5의 추가를 변형 등의 파생 DNA. FRT 사이트는 Flp recombinase (10)에 의해 중재 선택 마커의 사이트 감독 절단 할 수 있습니다.

세 가지 예 대표 결과는 6도 4에 표시됩니다. 첫 번째 접근 방식은 이웃 한 유전자에게 ctxA과 ctxB을 삭제하기위한. 이들은 V.의 주요 독성 계수를 인코딩 cholerae, 콜레라 독소. 위에서 설명한 3 그림에 따라 우리는 TransFLP 방법에 대한 oligonucleotides를 설계했습니다. 부모의 변형은 ctxAB의 원래 DNA의 궤적과 ctxAB에 대한 삭제 저항 카세트의 해제 ...

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의 게놈을 수정하는 빠른 방법<em&gt; V. cholerae</em&gt;이 설명되어 있습니다. 이 수정 한 유전자, 유전자 클러스터와 게놈 섬뿐만 아니라 짧은 시퀀스 (예 : 프로모터 요소 또는 선호도 태그 시퀀스)의 통합의 삭제가 포함되어 있습니다. 방법은 자연의 변화와 FLP-재조합에 기반을두고 있습니다.

TransFLP - 유 전적으로 수정하는 방법<em&gt; 장염 cholerae</em&gt; 자연 변화와 FLP-재조합에 근거

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