Name: studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos
Uploaded: 2012-06-14T13:00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos at JoVE.com

وقد تم تطوير هذا البروتوكول في إطار منحة يلكوم ترست. نشكر السيدة مورين سينكلير للحفاظ على مخزون الطاير وإعداد الطعام ذبابة على مر السنين. ونود أيضا أن نشكر السيد مايكل Aitchison لمساعدته وتقديم الدعم التقني في البلدان النامية من هذا البروتوكول.

<ol>
	<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).</li><li>Zekanowski, C., Wojda, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy,+chromosomal+missegregation,+and+cell+cycle+reentry+in+Alzheimer's+disease.">Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).</li><li>Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+a+spindle+checkpoint.">Flies without a spindle checkpoint.</a> Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).</li><li>Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Cdc20+by+Bub1+provides+a+catalytic+mechanism+for+APC/C+inhibition+by+the+spindle+checkpoint.">Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint.</a> Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).</li><li>Huang, J., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disappearance+of+cyclin+B+at+the+end+of+mitosis+is+regulated+spatially+in+Drosophila+cells.">The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells.</a> EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).</li><li>Xia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+binding+of+p31(comet)+antagonizes+the+function+of+Mad2+in+the+spindle+checkpoint.">Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint.</a> Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).</li><li>Lorca, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fizzy+is+required+for+activation+of+the+APC/cyclosome+in+Xenopus+egg+extracts.">Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts.</a> Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).</li><li>Howell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein/dynactin+drives+kinetochore+protein+transport+to+the+spindle+poles+and+has+a+role+in+mitotic+spindle+checkpoint+inactivation.">Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation.</a> J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).</li><li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis.">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).</li><li>Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Cdc20+to+the+kinetochore+requires+BubR1+but+not+Mad2+in+Drosophila+melanogaster.">Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster.</a> Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).</li><li>Karess, R. E., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+element+mediated+germ+line+transformation+of+Drosophila.">P element mediated germ line transformation of Drosophila.</a> DNA cloning: A practical approach. 2, 121-141 (1985).</li><li>Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+have+a+role+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+early+Drosophila+embryos.">Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos.</a> Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).</li><li>Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+localisation+of+the+Drosophila+APC/C:+evidence+for+the+existence+of+multiple+complexes+that+perform+distinct+functions+and+are+differentially+localised.">The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised.</a> Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).</li><li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+Fzy/Cdc20+and+Fzr/Cdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time.">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+Techniques+for+Studying+Mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+Syncytial+Embryo.">Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo.</a> J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cell+Shape+Change+in+Living+Drosophila+Embryos.">Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

بروتوكول الموصوفة هنا هو طريقة عامة لتصوير الأجنة يطير المخلوي باستخدام TCS لايكا ليزر متحد البؤر SP2 مجهر المسح ويمكن تعديلها لتناسب أنظمة المجهر الأخرى، ويمكن أيضا أن تتكيف مع دراسة وظائف الجينات الأخرى التي تستخدم أجنة ذبابة الفاكهة المخلوي. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لدراسة جوانب كثيرة من حاجز المغزل الجمعية، وديناميات البروتين والتحلل البروتيني بروتين باستخدام الذباب المعدلة وراثيا أو الأجسام المضادة بولكلونل لتصور توطين البروتين في عينات حية أو ثابت 4،6،12-14. فمن أبسط للحفاظ على الذباب في قوارير جديدة الغذائية ذبابة عند جمع أعداد صغيرة (~ 10 - 100) من البيض. وهذا يقلل من الازعاج من صنع وإعداد لوحات إضافية أجار عصير التفاح والغرف جمع البيض كما هو موضح في غيرها من المنشورات 15،16. إضافة مربع صغير من زجاج مكسور ساترة في واحدة من نهاية الشريط الغراء على ساترة يجعل من الاسهل بكثيرلفتح إبرة وتحديد حجم حقن عن طريق ضبط إعدادات النظام microinjection بينما الإبرة وتخبط في مجال النفط 10S. درجة جفاف الجنين من المهم لنجاح الحقن في تجنب التسربات والحفاظ على سلامة الأجنة وخاصة لأولئك التجارب التي تحتاج إلى فترة طويلة من الوقت أو عندما رفع transformants بعد الحقن. ومع ذلك، لا توجد قاعدة ذهبية للبالضبط كيف طويل هو مطلوب جفاف. هذا يختلف من تجربة إلى تجربة ويعتمد على مقدار من الحل حقن والرطوبة في بيئة العمل. يمكن التلاعب بها وظائف بروتين معين من الاهتمام من قبل microinjecting مثبطات بروتين معين، أحادية أو بولي نسيلي أجسام مضادة ضد بروتين معين، أو الحمض النووي الريبي رسول الببتيدات fluorescently المسمى تحت نوع البرية أو الخلفيات طفرة جينية. كثير من هذه الخطوط أو متحولة GFP الموسومة خطوط المعدلة وراثيا هي مركبات علناوترد ailable من مراكز الأوراق المالية ذبابة الفاكهة ومعظمها في Flybase ( <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ) ويمكن البحث على الانترنت.

الأساسية والمعدات والكواشف: مبائر نظام التصوير: نظام التصوير الموصوفة في هذا البروتوكول هو TCS لايكا SP2 ليزر متحد البؤر المسح نظام مجهر مقلوب. الأسلوب هو موضح هو أيضا مناسبة ربما مع بعض التعديلات الطفيفة لأنظمة التصوير الأخرى. تشريح المجهر: نحن نستخدم SZX7 أوليمبوس مع PLAPO 1X DF-4 عدسة. إبرة مجتذب: المشتعلة / براون micropipette مجتذب (سوتر من نموذج، الآلة: P-97). نظام Microinjection: يوصف نظام microinjection إيبندورف لكن يمكن استخدام أي نظام آخر مناسب. يطير موزع الغذاء: Jencons العلمية مضخة تحوي المحدودة. الكواشف: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المكونات </td><td> الوزن<html> ق </td><td> موارد </td><td> الكثير رقم </td></tr><tr><td> الذرة وجبة </td><td> 100.0g </td><td> SUMA، المملكة المتحدة </td><td></td></tr><tr><td> السكر البني </td><td> 50.0g </td><td> بيلينغتون، والمملكة المتحدة </td><td></td></tr><tr><td> خميرة جافة </td><td> 25.0g </td><td> DCL خميرة المملكة المتحدة المحدودة. </td><td></td></tr><tr><td> أجار </td><td> 12.5g </td><td> فيشر العلمية </td><td> 106556 </td></tr><tr><td> السوربيك حمض </td><td> 0.4g </td><td> BDH، VWR الدولية المحدودة في المملكة المتحدة </td><td> 8829310 </td></tr><tr><td> بنزويك </td><td> 2.9g </td><td> فيشر العلمية </td><td> 1019599 </td></tr><tr><td> Nipagin (الميثيل-4-هيدرو xybenzoate) </td><td> 0.9g </td><td> BDH، VWR الدولية المحدودة في المملكة المتحدة </td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> H 2 O يصل الى 1L </td><td></td></tr></tbody></table>الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; الجدول رقم 1. تطير المكونات الغذائية. Holocarbon 700 و 27 الزيوت التي تم شراؤها من شركة سيجما. خميرة جافة: توماس أليسون، المملكة المتحدة. إعداد الغراء هيبتان: خذ حوالي 1.5 متر من الشريط سكوتش على الوجهين، ووضعها في أنبوب الصقر 15ml مع 5ml من هيبتان وتدويره لمدة 3-5 ساعات أو بين عشية وضحاها. بعد ذلك الوقت انقسم الى 4 aliquots على قدم المساواة في 1.5 مل من أنابيب الطرد المركزي إيبندورف وتدور لمدة 5 دقائق في وقت سريع في جهاز للطرد المركزي مقاعد البدلاء أعلى لإزالة أي حطام. تخزين حل الغراء هيبتان في القارورة الحجمية 10ML والحفاظ على لاستخدامها. فإن قوة الغراء تختلف وفقا لتركيز وكميات من الصمغ المستخدمة. عادة، وأرق الغراء تنتج أقل خلفية صاخبة عندما تم فحصها بواسطة المجهر متحد البؤر. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساترة: BDH، VWR الدولية المحدودة في المملكة المتحدة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة المجهر: BDH، VWR الدولية المحدودة في المملكة المتحدة &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Siliconised زجاج الشعيرات الدموية: GC-100-10، في جامعة هارفارد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غرامة غيض التحميل: 20μl إيبندورف الكثير: W215818J </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاقيط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غرامة القلم الفرشاة </li></ul>

studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos

حاجز الجمعية المغزل (SAC) آلية هي إشارة نشط، والذي يراقب التفاعل بين kinetochores كروموسوم وميكروتثبول المغزل للحيلولة دون ظهور طور الصعود حتى ترتبط بشكل صحيح الكروموسومات. الخلايا استخدام هذه الآلية لمنع عدم الاستقرار أو عدم توازن الصبغيات الجينية، وبالتالي السرطان والأمراض البشرية الأخرى مثل العيوب الخلقية ومرض الزهايمر 1. وهناك عدد من المكونات مثل SAC Mad1، Mad2، Bub1، BubR1، Bub3، Mps1، Zw10، وقد تم تحديد ورود أورورا كيناز باء، وأنهم جميعا البروتينات kinetochore الدينامية (2). تشير الدلائل إلى أن kinetochore هو المكان الذي بدأ إشارة ساك. الهدف الرئيسي ساك التنظيمية Cdc20. Cdc20 هي واحدة من وسائل تفعيل APC / C (أ ف naphase romoting C omplex أو yclosome C) (3) وأساسي هو أيضا بروتين kinetochore دينامية 4-6. عند تفعيلها، وSAC يثبط من نشاط وPC / C لمنع تدمير اثنين من ركائز رئيسية، cyclin باء وsecurin، مما يحول دون انتقال الطورية إلى طور الصعود 7،8. بالضبط كيف يتم بدء إشارة SAC وتجميعها على kinetochores ونقلت على لآسيا والمحيط الهادئ / C لمنع وظيفتها لا تزال بعيدة المنال. ذبابة الفاكهة هو نظام لين العريكة جدا التجريبي؛ كائن أبسط من ذلك بكثير وأفضل مفهومة مقارنة مع واحد ولكن الإنسان الذي أسهم في العمليات الأساسية المشتركة. هو، ربما، واحدة من أفضل الكائنات الحية لاستخدامها في التصوير دراسات البيولوجية في الخلايا الحية، وخاصة بالنسبة للالتصور للأحداث الإنقسامية في المكان والزمان، كما أن الجنين في وقت مبكر يذهب من خلال 13 دورات السريع تقسيم النووية بشكل متزامن (8-10 دقائق لكل دورة على درجة مئوية 25)، وتنظم تدريجيا نوى في أحادي الطبقة واحدة فقط تحت القشرة 9. هنا، أقدم طريقة الحيوي التصوير باستخدام المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة EXPRESالغناء GFP (الأخضر بروتين فلوري) أو البديل لها استهداف البروتينات من الفائدة وTCS لايكا SP2 نظام ليزر متحد البؤر مجهر المسح لدراسة وظيفة SAC في الذباب، من جراء عرض صور من البروتينات الانصهار GFP من بعض المكونات SAC، Cdc20 وMad2 ، كما في المثال.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos at JoVE.com

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

وkinetochore هو المكان الذي يبدأ SAC الاشارة رصد الفصل الإنقسامية من chromatids شقيقة. تم وصف طريقة لتصور التوظيف ودوران واحد من البروتينات kinetochore والتنسيق مع الحركة في كروموسوم<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أجنة باستخدام نظام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر لايكا.

دراسة حاجز الميتوزى بواسطة يوضح الحيوي Kinetochore السلوك البروتين والحركة كروموسوم في المعيشة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الجنين المخلوي

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

دراسة العدوان في ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

تطبيق فاتح الشفاء الراتنج لاصق الأسنان أو تركيب لأقطاب مجسات Microdialysis في التجارب المزمنة

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

عالية الدقة قياس سلوك رائحة يحركها يرقات ذبابة الفاكهة في

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

رني التدخل عن طريق الحقن في الرنا المزدوج الجديلة ذبابة الفاكهة الأجنة

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

تحديد البروتين البروتين التفاعل في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء الكبار حسب جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...