Name: studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos
Uploaded: 2012-06-14T13:00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos at JoVE.com

פרוטוקול זה פותח תחת האמון Wellcome גרנט. אנו מודים לגב &#39;מורין סינקלייר לשמירה המניות לטוס והכנת מזון זבוב עם השנים. אנו רוצים גם להודות למר מיכאל אייצ&#39;יסון על עזרתו ותמיכה טכנית בפיתוח של פרוטוקול זה.

<ol>
	<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).</li><li>Zekanowski, C., Wojda, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy,+chromosomal+missegregation,+and+cell+cycle+reentry+in+Alzheimer's+disease.">Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).</li><li>Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+a+spindle+checkpoint.">Flies without a spindle checkpoint.</a> Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).</li><li>Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Cdc20+by+Bub1+provides+a+catalytic+mechanism+for+APC/C+inhibition+by+the+spindle+checkpoint.">Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint.</a> Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).</li><li>Huang, J., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disappearance+of+cyclin+B+at+the+end+of+mitosis+is+regulated+spatially+in+Drosophila+cells.">The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells.</a> EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).</li><li>Xia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+binding+of+p31(comet)+antagonizes+the+function+of+Mad2+in+the+spindle+checkpoint.">Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint.</a> Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).</li><li>Lorca, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fizzy+is+required+for+activation+of+the+APC/cyclosome+in+Xenopus+egg+extracts.">Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts.</a> Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).</li><li>Howell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein/dynactin+drives+kinetochore+protein+transport+to+the+spindle+poles+and+has+a+role+in+mitotic+spindle+checkpoint+inactivation.">Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation.</a> J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).</li><li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis.">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).</li><li>Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Cdc20+to+the+kinetochore+requires+BubR1+but+not+Mad2+in+Drosophila+melanogaster.">Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster.</a> Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).</li><li>Karess, R. E., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+element+mediated+germ+line+transformation+of+Drosophila.">P element mediated germ line transformation of Drosophila.</a> DNA cloning: A practical approach. 2, 121-141 (1985).</li><li>Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+have+a+role+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+early+Drosophila+embryos.">Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos.</a> Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).</li><li>Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+localisation+of+the+Drosophila+APC/C:+evidence+for+the+existence+of+multiple+complexes+that+perform+distinct+functions+and+are+differentially+localised.">The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised.</a> Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).</li><li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+Fzy/Cdc20+and+Fzr/Cdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time.">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+Techniques+for+Studying+Mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+Syncytial+Embryo.">Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo.</a> J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cell+Shape+Change+in+Living+Drosophila+Embryos.">Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

פרוטוקול המתוארת כאן היא שיטה גנרית עבור הדמיה לטוס עוברים סינסיציאלי באמצעות TCS Leica SP2 confocal מיקרוסקופ לייזר סורק והוא יכול להיות שונה כדי להתאים מערכות מיקרוסקופ אחרים, ויכול גם להיות מותאם ללמוד פונקציות גנים אחרים באמצעות עוברים תסיסנית סינסיציאלי. השתמשנו בפרוטוקול זה ללמוד היבטים רבים של המחסום ציר הרכבה, הדינמיקה חלבון proteolysis חלבון מהונדס באמצעות זבובים או נוגדנים polyclonal לדמיין לוקליזציה חלבונים בדגימות חיים או קבועים 4,6,12-14. היא הפשוטה ביותר לשמור על זבובים ב צלוחיות מזון טרי לטוס בעת איסוף מספר קטן (~ 10-100) של ביצים. פעולה זו מפחיתה את הטרחה של ביצוע והכנת נוספים אגר מיץ תפוחים צלחות איסוף בתאי ביצה כפי שמתואר בפרסומים אחרים 15,16. תוספת של ריבוע קטן של זכוכית שבורה coverslip בקצה אחד של רצועת דבק על coverslip עושה את זה הרבה יותר קלכדי לפתוח את המחט לקבוע את עוצמת הזריקה באמצעות התאמת מערכת הגדרות microinjection תוך המחט הוא לטבול בשמן 10s. מידת התייבשות העובר חשוב להצלחה של הזריקה למניעת דליפות ושמירה על יכולת הקיום עוברים במיוחד עבור אלה ניסויים הדורשים תקופת זמן ארוכה או כאשר העלאת transformants לאחר ההזרקה. עם זאת, אין כלל הזהב עבור בדיוק כמה זמן נדרש התייבשות. פעולה זו שונה בין ניסוי לניסוי וגם תלוי בכמות של פתרון מוזרק והלחות של סביבת העבודה. פונקציות של חלבון מסוים שמעניין ניתן להשפיע על ידי microinjecting מעכבי חלבונים ספציפיים, מונו או פולי משובט נוגדנים נגד חלבון מסוים, RNA שליח או פפטידים שכותרתו fluorescently תחת סוג בר או רקע מוטציה גנטית. רבים מאותם קווים מוטנטים או GFP-מתוייגים קווי מהונדס הם באב פומביתailable מ תסיסנית מניות מרכזי ורובם מפורטים על Flybase ( <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ), ואפשר לחפש באינטרנט.

ציוד חיוני ריאגנטים: מערכת הדמיה confocal: מערכת הדמיה שתואר בפרוטוקול זה הוא TCS Leica SP2 סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal מערכת הפוכה. בשיטה המתוארת מתאימה גם אולי עם כמה שינויים קלים עבור מערכות הדמיה אחרים. לנתח את המיקרוסקופ: אנו משתמשים SZX7 אולימפוס עם DF PLAPO 1X-4 העדשה. מחט חולץ: בוער / חום micropipette חולץ (ממודל כלי סאטר,: P-97). מערכת Microinjection: מערכת microinjection Eppendorf מתואר אבל כל מערכת מתאימה אחרת ניתן להשתמש. טוס מפיץ מזון: Jencons מדעי משאבת בע&quot;מ peristaltic. ריאגנטים: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מרכיבים </td><td> משקל<html> של </td><td> משאבים </td><td> הרבה לא. </td></tr><tr><td> תירס ארוחה </td><td> 100.0g </td><td> SUMA, בריטניה </td><td></td></tr><tr><td> סוכר חום </td><td> 50.0g </td><td> Billington של בריטניה </td><td></td></tr><tr><td> שמרים יבשים </td><td> 25.0g </td><td> מת&quot;ק שמרים בע&quot;מ בבריטניה </td><td></td></tr><tr><td> אגר </td><td> 12.5g </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 106556 </td></tr><tr><td> Sorbic חומצה </td><td> 0.4g </td><td> BDH, VWR אינטרנשיונל בע&quot;מ בבריטניה </td><td> 8829310 </td></tr><tr><td> חומצה בנזואית </td><td> 2.9g </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 1019599 </td></tr><tr><td> Nipagin (Methyl-4-Hydro xybenzoate) </td><td> 0.9g </td><td> BDH, VWR אינטרנשיונל בע&quot;מ בבריטניה </td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> H 2 O עד 1 ליטר </td><td></td></tr></tbody></table>class = &quot;jove_content&quot;&gt; בטבלה 1. טוס רכיבי מזון. Holocarbon 700 ו 27 שמנים שנרכשו סיגמא. שמרים יבשים: תומס אליסון, בריטניה. הכנת דבק heptane: קח כ -1.5 מטרים של סרט דו צדדית ויסקי, הכניסו אותו לתוך צינור פלקון 15 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל של heptane וסובב במשך 3-5 שעות או לילה. לאחר תקופה מחולקים 4 aliquots שווים 1.5 צינורות מ&quot;ל eppendorf צנטריפוגות ומסובב 5 דקות במהירות מהירה בצנטריפוגה הספסל העליון להסיר כל לכלוך. אחסן את הפתרון דבק heptane בבקבוק 10 מ&quot;ל נפח ולשמור לשימוש. הכוח דבק ישתנה בהתאם ריכוז סכומי דבק בו. בדרך כלל, דק יותר דבק מייצרת רעש רקע נמוך יותר כאשר סרק על ידי מיקרוסקופ confocal. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip: BDH, VWR אינטרנשיונל בע&quot;מ בבריטניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות מיקרוסקופ: BDH, VWR אינטרנשיונל בע&quot;מ בריטניה &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Siliconised זכוכית נימים: GC-100-10, הרווארד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוען עצה פיין: 20μl הרבה eppendorf: W215818J </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקטת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עט פיין מברשת </li></ul>

studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos

הרכבה ציר מחסום (SAC) המנגנון הוא אות הפעיל, העוקב אחר האינטראקציה בין kinetochores כרומוזום microtubules ציר כדי למנוע התפרצות anaphase עד הכרומוזומים מחוברים כראוי. תאים משתמשים מנגנון זה, כדי למנוע חוסר יציבות גנומית או aneuploidy, ולכן סרטן ומחלות אנושיות אחרות, כמו מומים מולדים ואלצהיימר 1. מספר הרכיבים שק כגון Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, רוד ואורורה ב קינאז זוהו והם כל החלבונים דינמיים kinetochore 2. הראיות עולה כי kinetochore הוא שם את האות SAC היא יזמה. המטרה העיקרית היא SAC הרגולציה Cdc20. Cdc20 הוא אחד APC / C (P naphase romoting omplex C או C yclosome) activators חיוניים 3, והוא גם חלבון דינמי kinetochore 4-6. כאשר מופעל, SAC מעכב את הפעילות שלPC / C כדי למנוע את הרס שני מצעים מרכזיים, cyclin B ו-securin, ובכך למנוע metaphase כדי anaphase המעבר 7,8. בדיוק איך האות SAC הוא יזם התאספו על kinetochores את ומסר על הנגמ&quot;ש / C לעכב את תפקידו עדיין נשאר חמקמק. תסיסנית היא מערכת ניסיונית צייתן מאוד, אורגניזם פשוט יותר וטוב יותר מובנות לעומת האדם אבל אף אחד כי תהליכים מניות יסוד משותפים. זהו, אולי, אחד היצורים הטובים ביותר לשימוש עבור ביו הדמיה מחקרים בתאים חיים, במיוחד עבור הדמיה של אירועי mitotic במרחב ובזמן, שכן העובר בשלב מוקדם עובר 13 מחזורים מהירים חטיבת גרעיני באופן סינכרוני (8-10 דקות לכל מחזור של 25 ° C) ולאט לאט מארגנת גרעינים בשכבה יחידה בדיוק מתחת קליפת המוח 9. הנה, אני מציג את שיטת ביו הדמיה באמצעות מהונדס תסיסנית הבעהשרים GFP (חלבון ירוק זרחני) או חלבונים גרסה במיקוד שלה של ריבית TCS Leica SP2 confocal מערכת לייזר מיקרוסקופ סריקה כדי ללמוד את הפונקציה SAC אצל זבובי, על ידי הצגת תמונות של חלבונים GFP שילוב של כמה מרכיבים SAC, Cdc20 ו Mad2 , כמו בדוגמה.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos at JoVE.com

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה כרומוזום<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים באמצעות לייזר Leica מערכת סריקה confocal.

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

לימוד תוקפנות תסיסנית (זבובי פירות)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

יישום של שרף אור נרפא, דבק שיניים אלקטרודות הרכבה או בדיקות Microdialysis בניסויים כרונית

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...