Name: studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos
Uploaded: 2012-06-14T13:00:00
Duration: 13 min 59 s
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इस प्रोटोकॉल वेलकम ट्रस्ट अनुदान के तहत विकसित किया गया था. हम मक्खी के शेयरों को बनाए रखने और पिछले कुछ वर्षों में मक्खी भोजन को तैयार करने के लिए सुश्री मॉरीन Sinclair धन्यवाद. हम भी उसके और इस प्रोटोकॉल के विकास में तकनीकी सहायता की मदद के लिए धन्यवाद श्री माइकल Aitchison चाहते हैं.

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	<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).</li><li>Zekanowski, C., Wojda, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy,+chromosomal+missegregation,+and+cell+cycle+reentry+in+Alzheimer's+disease.">Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).</li><li>Buffin, E., Emre, D., Karess, R. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disappearance+of+cyclin+B+at+the+end+of+mitosis+is+regulated+spatially+in+Drosophila+cells.">The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells.</a> EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).</li><li>Xia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+binding+of+p31(comet)+antagonizes+the+function+of+Mad2+in+the+spindle+checkpoint.">Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint.</a> Embo. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis.">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).</li><li>Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Cdc20+to+the+kinetochore+requires+BubR1+but+not+Mad2+in+Drosophila+melanogaster.">Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster.</a> Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).</li><li>Karess, R. E., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+element+mediated+germ+line+transformation+of+Drosophila.">P element mediated germ line transformation of Drosophila.</a> DNA cloning: A practical approach. 2, 121-141 (1985).</li><li>Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+have+a+role+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+early+Drosophila+embryos.">Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos.</a> Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).</li><li>Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+localisation+of+the+Drosophila+APC/C:+evidence+for+the+existence+of+multiple+complexes+that+perform+distinct+functions+and+are+differentially+localised.">The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised.</a> Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).</li><li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+Fzy/Cdc20+and+Fzr/Cdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time.">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+Techniques+for+Studying+Mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+Syncytial+Embryo.">Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo.</a> J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cell+Shape+Change+in+Living+Drosophila+Embryos.">Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).</li></ol>

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

यहां वर्णित प्रोटोकॉल इमेजिंग syncytial एक Leica टीसीएस SP2 के लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग भ्रूण मक्खी और अन्य खुर्दबीन सिस्टम के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है और भी अन्य जीन ड्रोसोफिला syncytial भ्रूण का उपयोग कर कार्यों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के लिए एक सामान्य तरीका है. हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है धुरी विधानसभा जांच की चौकी, प्रोटीन गतिशीलता और प्रोटीन ट्रांसजेनिक मक्खियों या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए जीवित या फिक्स्ड 4,6,12-14 नमूनों में प्रोटीन स्थानीयकरण कल्पना proteolysis के कई पहलुओं का अध्ययन. यह सरल है ताजा मक्खी भोजन शीशियों में मक्खियों रखने के लिए जब अंडे की छोटी संख्या (~ 10 - 100) का संग्रह है. यह बनाने और अन्य 15,16 प्रकाशनों में वर्णित के रूप में अतिरिक्त सेब का रस अगर प्लेटें और अंडे संग्रह कक्षों की तैयारी की परेशानी को कम कर देता है. coverslip पर गोंद पट्टी के एक छोर पर टूटी हुई coverslip कांच का एक छोटा सा वर्ग के अलावा यह एक बहुत आसान बना देता हैसुई को खोलने के लिए और इंजेक्शन की मात्रा का निर्धारण microinjection प्रणाली सेटिंग्स समायोजित जबकि सुई 10S तेल में डुबो रहा है. भ्रूण के शुष्क्ीकरण की डिग्री इंजेक्शन की चोरी से बचने और उन प्रयोगों जो समय की एक लंबी अवधि की आवश्यकता होती है या इंजेक्शन के बाद जब transformants जुटाने के लिए विशेष रूप से भ्रूण व्यवहार्यता को बनाए रखने में सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, वहाँ वास्तव में कितनी देर तक सुखाना की आवश्यकता है के लिए कोई सुनहरा नियम है. इस प्रयोग से प्रयोग करने के लिए भिन्न होता है और इंजेक्शन समाधान और काम वातावरण की नमी की मात्रा पर निर्भर करता है. ब्याज की एक विशिष्ट प्रोटीन का कार्य एक विशिष्ट प्रोटीन, दूत शाही सेना या जंगली प्रकार या आनुवंशिक उत्परिवर्तन पृष्ठभूमि के तहत fluorescently लेबल पेप्टाइड्स के खिलाफ मोनो या पाली clonal एंटीबॉडी विशिष्ट प्रोटीन inhibitors, microinjecting द्वारा चालाकी से किया जा सकता है. इन उत्परिवर्ती लाइनों या GFP टैग ट्रांसजेनिक लाइनों के कई सार्वजनिक av हैंड्रोसोफिला स्टॉक केन्द्रों और उनमें से ज्यादातर से ailable Flybase (पर सूचीबद्ध हैं <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ) और ऑनलाइन के लिए खोजा जा सकता है.

आवश्यक उपकरण और अभिकर्मकों: Confocal इमेजिंग प्रणाली: इस प्रोटोकॉल में वर्णित इमेजिंग प्रणाली Leica टीसीएस SP2 स्कैनिंग लेजर confocal उलटा माइक्रोस्कोप प्रणाली है. अन्य इमेजिंग सिस्टम के लिए कुछ मामूली संशोधनों के साथ वर्णित विधि भी शायद उपयुक्त है. खुर्दबीन विदारक: हम लोमो PLAPO लेंस 1X-4 के साथ एक ओलिंप SZX7 का उपयोग करें. सुई डांड़ी: / भूरे रंग micropipette डांड़ी: P-97 Sutter साधन, मॉडल से ज्वलंत. Microinjection प्रणाली: एक Eppendorf microinjection प्रणाली वर्णित है लेकिन किसी भी अन्य उपयुक्त प्रणाली का इस्तेमाल किया जा सकता है. भोजन वितरक फ्लाई Jencons वैज्ञानिक लिमिटेड क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप:. अभिकर्मकों: <table border="1"><tbody><tr><td> सामग्री </td><td> भारहै </td><td> संसाधन </td><td> लॉट नहीं. </td></tr><tr><td> मक्का भोजन </td><td> 100.0g </td><td> सुमा, ब्रिटेन </td><td></td></tr><tr><td> ब्राउन शुगर </td><td> 50.0g </td><td> बिलिंगटन, ब्रिटेन </td><td></td></tr><tr><td> सूखी खमीर </td><td> 25.0g </td><td> DCL खमीर लिमिटेड ब्रिटेन </td><td></td></tr><tr><td> अगर </td><td> 12.5g </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> +१०६५५६ </td></tr><tr><td> Sorbic एसिड </td><td> 0.4g </td><td> BDH, VWR इंटरनेशनल लिमिटेड ब्रिटेन </td><td> 8829310 </td></tr><tr><td> यह चर्म विशल्क मरहमों में एवं भोजन के परिरक्षक के रूप में काम आता है </td><td> 2.9g </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 1019599 </td></tr><tr><td> Nipagin (मिथाइल-4-हाइड्रो xybenzoate) </td><td> 0.9g </td><td> BDH, VWR इंटरनेशनल लिमिटेड ब्रिटेन </td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> एच 2 1L के लिए हे </td><td></td></tr></tbody></table><pवर्ग = &quot;jove_content&quot;&gt; तालिका 1. खाद्य सामग्री उड़ना. 700 और 27 से सिग्मा खरीदा तेल holocarbon. सूखी खमीर: थॉमस एलीसन, ब्रिटेन. हेपटैन गोंद की तैयारी: डबल पक्षीय स्कॉच टेप के बारे में 1.5 मीटर की दूरी पर ले लो, यह एक 15ml फाल्कन ट्यूब में हेपटैन के 5ml के साथ डाल दिया और 3-5 घंटे या रात भर के लिए बारी बारी से. उस समय के बाद 1.5 मिलीलीटर Eppendorf अपकेंद्रित्र ट्यूबों में 4 बराबर aliquots में विभाजित है और एक पीठ टॉप अपकेंद्रित्र में एक तेज गति से 5 मिनट के लिए स्पिन करने के लिए किसी भी मलबे को हटाने. एक 10ml बड़ा फ्लास्क में हेपटैन गोंद के समाधान स्टोर और उपयोग के लिए रहते हैं. गोंद शक्ति एकाग्रता और इस्तेमाल किया गोंद की मात्रा के अनुसार अलग अलग होंगे. आम तौर पर, पतली गोंद कम शोर पृष्ठभूमि जब confocal सूक्ष्मदर्शी द्वारा स्कैन पैदा करता है. <ul><li> Coverslip: BDH, VWR इंटरनेशनल लिमिटेड ब्रिटेन </li><li> माइक्रोस्कोप स्लाइड: BDH, VWR इंटरनेशनल लिमिटेड ब्रिटेन &lt;/ Li&gt; <li> Siliconised कांच के capillaries: जीसी-100-10 हार्वर्ड, </li><li> ठीक लोड हो रहा है टिप: 20μl Eppendorf बहुत: W215818J </li><li> चिमटी </li><li> ठीक कलम ब्रश </li></ul>

studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos

धुरी विधानसभा चौकी तंत्र (एसएसी) के एक सक्रिय संकेत है, जो गुणसूत्र kinetochores और तकला सूक्ष्मनलिकाएं के बीच बातचीत पर नज़र रखता है जब तक गुणसूत्रों ठीक से जुड़े हुए हैं पश्चावस्था शुरुआत को रोकने के है. कोशिकाओं aneuploidy या जीनोमिक अस्थिरता, और इसलिए कैंसर और जन्म दोष और अल्जाइमर एक जैसे अन्य मानव रोगों को रोकने के लिए इस तंत्र का उपयोग करने के लिए. Mad1 जैसे सैक घटकों के एक नंबर, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, रॉड और अरोड़ा बी kinase की पहचान की गई है और वे सभी kinetochore गतिशील प्रोटीन कर रहे हैं 2. प्रमाण बताते हैं कि kinetochore जहां सैक संकेत शुरू की है. सैक प्रधानमंत्री नियामक लक्ष्य Cdc20 है. Cdc20 आवश्यक APC / सी (ए पी naphase romoting ग omplex या सी yclosome के) 3 activators में से एक है और भी kinetochore गतिशील 4-6 प्रोटीन है. सैक, जब सक्रिय एक की गतिविधि को रोकता हैपीसी / सी के दो प्रमुख substrates, cyclin बी securin के विनाश को रोकने के लिए, जिससे लिए 7,8 संक्रमण पश्चावस्था मेटाफ़ेज़ रोकने. बिल्कुल सही कैसे सैक संकेत शुरू की है और इकट्ठे और kinetochores पर APC / सी पर प्रसारित को बाधित करने के लिए अपने कार्य अभी भी मायावी रहता है. ड्रोसोफिला एक अत्यंत विनयशील प्रायोगिक प्रणाली है, मानव एक है, लेकिन तुलना में एक बहुत सरल और बेहतर - समझ जीव शेयर आम में मौलिक प्रक्रियाओं कि. यह है, शायद, एक सबसे अच्छा जीवों के लिए जीवित कोशिकाओं में जैव इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयोग, अंतरिक्ष और समय में mitotic की घटनाओं के दृश्य के लिए विशेष रूप से, जल्दी भ्रूण के रूप में 13 तेजी से परमाणु विभाजन तुल्यकालित चक्र (8-10 मिनट के माध्यम से चला जाता है 25 ° सी) में प्रत्येक चक्र के लिए और धीरे - धीरे 9 प्रांतस्था नीचे सिर्फ एक monolayer में नाभिक का आयोजन. यहाँ, मैं एक जैव इमेजिंग ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला अभिव्यक्ति पद्धति का उपयोग करके प्रस्तुतGFP गाना (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) या ब्याज और एक Leica टीसीएस SP2 के लेजर confocal स्कैनिंग खुर्दबीन लिए GFP सैक के कुछ घटकों के संलयन प्रोटीन, Cdc20 और Mad2 की छवियाँ दिखा द्वारा मक्खियों में सैक समारोह अध्ययन प्रणाली के संस्करण लक्षित प्रोटीन उदाहरण के रूप में.

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Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

kinetochore है जहां सैक अपनी बहन क्रोमेटिडों की mitotic अलगाव की निगरानी के संकेत शुरू की. एक विधि के लिए में गुणसूत्र गति के साथ भर्ती और kinetochore प्रोटीन और उसके समन्वय के कारोबार कल्पना में वर्णित है<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Leica स्कैनिंग लेजर confocal प्रणाली का उपयोग भ्रूण.

Illustrating के गतिशील kinetochore प्रोटीन और रहने में क्रोमोजोम प्रस्ताव व्यवहार के द्वारा mitotic चेकप्वाइंट अध्ययन<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Syncytial भ्रूण

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

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