Name: studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos
Uploaded: 2012-06-14T13:00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos at JoVE.com

Этот протокол был разработан в рамках Wellcome Trust грант. Мы благодарим г-жа Морин Sinclair для поддержания лету запасов и подготовке лету пищу на протяжении многих лет. Мы также хотели бы поблагодарить г-на Майкла Aitchison за помощь и техническую поддержку в разработке этого протокола.

<ol>
	<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).</li><li>Zekanowski, C., Wojda, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy,+chromosomal+missegregation,+and+cell+cycle+reentry+in+Alzheimer's+disease.">Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).</li><li>Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+a+spindle+checkpoint.">Flies without a spindle checkpoint.</a> Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).</li><li>Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Cdc20+by+Bub1+provides+a+catalytic+mechanism+for+APC/C+inhibition+by+the+spindle+checkpoint.">Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint.</a> Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).</li><li>Huang, J., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disappearance+of+cyclin+B+at+the+end+of+mitosis+is+regulated+spatially+in+Drosophila+cells.">The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells.</a> EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).</li><li>Xia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+binding+of+p31(comet)+antagonizes+the+function+of+Mad2+in+the+spindle+checkpoint.">Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint.</a> Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).</li><li>Lorca, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fizzy+is+required+for+activation+of+the+APC/cyclosome+in+Xenopus+egg+extracts.">Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts.</a> Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).</li><li>Howell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein/dynactin+drives+kinetochore+protein+transport+to+the+spindle+poles+and+has+a+role+in+mitotic+spindle+checkpoint+inactivation.">Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation.</a> J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).</li><li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis.">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).</li><li>Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Cdc20+to+the+kinetochore+requires+BubR1+but+not+Mad2+in+Drosophila+melanogaster.">Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster.</a> Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).</li><li>Karess, R. E., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+element+mediated+germ+line+transformation+of+Drosophila.">P element mediated germ line transformation of Drosophila.</a> DNA cloning: A practical approach. 2, 121-141 (1985).</li><li>Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+have+a+role+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+early+Drosophila+embryos.">Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos.</a> Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).</li><li>Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+localisation+of+the+Drosophila+APC/C:+evidence+for+the+existence+of+multiple+complexes+that+perform+distinct+functions+and+are+differentially+localised.">The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised.</a> Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).</li><li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+Fzy/Cdc20+and+Fzr/Cdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time.">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+Techniques+for+Studying+Mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+Syncytial+Embryo.">Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo.</a> J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cell+Shape+Change+in+Living+Drosophila+Embryos.">Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

Протокол, описанный здесь, является универсальным методом для работы с изображениями летать синцитиальный эмбрионов с использованием Leica TCS SP2 конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и может быть изменен в соответствии с другими системами микроскоп, а также может быть адаптирована для изучения других функций генов дрозофилы синцитиальный использованием эмбрионов. Мы использовали этот протокол для изучения многих аспектов контрольно-пропускном пункте шпиндельного узла, динамики белков и белков протеолиза использованием трансгенных мух или поликлональных антител для визуализации белка локализация в живых или фиксированных образцов 4,6,12-14. Проще всего мух в свежих флаконах пищи лету, собирая небольшое количество (~ 10 - 100) яиц. Это снижает хлопот решений и подготовке дополнительных яблочного сока агаром и камеры сбора яиц, как это описано в других изданиях 15,16. Помимо небольшого квадратного битого стекла покровного на одном конце полосы клея на покровное делает его намного прощеЧтобы открыть иглу и определения объема впрыска, регулируя настройки микроинъекции системы, а игла погружения в масло 10С. Степень высыхания эмбрион имеет важное значение для успешного введения в предотвращении утечек и поддержания жизнеспособности эмбрионов, особенно для тех экспериментов, которые требуют длительного периода времени или при повышении трансформантов после инъекции. Однако, нет золотого правила, сколько времени высыхания требуется. Это зависит от эксперимента к эксперименту и зависит от количества раствора вводят и влажность рабочей среды. Функции специфического белка интереса можно манипулировать microinjecting специфические ингибиторы белка, моно-или поли-клональных антител против специфического белка, РНК или флуоресцентно меченых пептидов в дикого типа или генетической мутации фона. Многие из этих мутантных линий или GFP с метками трансгенных линий публично пр.ailable от дрозофилы фондовых центров и большинство из них котируются на Flybase ( <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ) и может быть найден в Интернете.

Необходимое оборудование и реактивы: Конфокальной системы визуализации: изображение системы, описанной в этом протокол Leica TCS SP2 лазерной сканирующей конфокальной микроскопии перевернутой системе. Описанный метод также подходит, возможно, с некоторыми незначительными изменениями для других систем визуализации. Анатомический микроскоп: Мы используем Olympus SZX7 с DF PLAPO 1X-4 объектива. Иглы съемник: Горячие / коричневый микропипетки съемник (от Саттер инструмент, модель: Р-97). Микроинъекция системы: система Эппендорф микроинъекции описано, но любая другая соответствующая система может быть использована. Лети дистрибьютор продуктов питания: Jencons научно ООО перистальтического насоса. Реагенты: <table border="1"><tbody><tr><td> Ингредиенты </td><td> Весс </td><td> Ресурсы </td><td> Лот № </td></tr><tr><td> Кукурузной муки </td><td> 100,0 г </td><td> SUMA, Великобритания </td><td></td></tr><tr><td> Коричневый сахар </td><td> 50.0g </td><td> Биллингтон, в Великобритании </td><td></td></tr><tr><td> Сухие дрожжи </td><td> 25.0g </td><td> DCL дрожжей ООО Великобритании </td><td></td></tr><tr><td> Агар </td><td> 12.5g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 106556 </td></tr><tr><td> Сорбиновая кислота </td><td> 0,4 г </td><td> BDH, VWR International ООО Великобритании </td><td> 8829310 </td></tr><tr><td> Бензойная кислота </td><td> 2.9g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1019599 </td></tr><tr><td> Нипагин (Метил-4-Hydro xybenzoate) </td><td> 0.9g </td><td> BDH, VWR International ООО Великобритании </td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> H 2 O до 1л </td><td></td></tr></tbody></table><pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; Таблица 1. летать пищевых ингредиентов. Holocarbon 700 и 27 Масла приобрести Sigma. Сухие дрожжи: Томас Эллисон, Великобритания. Подготовка гептан клея: Возьмите около 1,5 метров двухсторонний скотч, положите его в 15 мл трубку Сокол с 5 мл гептана и вращать в течение 3-5 часов или на ночь. После этого разделить на 4 равные порции в пробирки на 1,5 мл Eppendorf центрифугу и крутить в течение 5 мин на высокой скорости в настольные центрифуги для удаления мусора. Хранить раствор клея гептана в 10 мл мерную колбу и сохранить для использования. Клей сила будет варьироваться в зависимости от концентрации и количества клея. Как правило, чем тоньше клей производит меньше шумовой фон при сканировании с помощью конфокальной микроскопии. <ul><li> Покровные: BDH, VWR International ООО Великобритании </li><li> Микроскоп слайдов: BDH, VWR International ООО Великобритании &lt;/ LI&gt; <li> Силиконизированная стеклянных капилляров: GC-100-10, Гарвардский </li><li> Изобразительное кончик нагрузка: 20 мкл Эппендорф много: W215818J </li><li> Пинцет </li><li> Изобразительное кисть </li></ul>

studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos

КПП шпиндельного узла (SAC) механизм активного сигнала, который контролирует взаимодействие между хромосомой кинетохоры и микротрубочки веретена, чтобы предотвратить наступление анафазы до хромосом подключены правильно. Клетки используют этот механизм для предотвращения анеуплоидия или геномной нестабильности и, следовательно, рака и других заболеваний человека, как врожденные пороки и болезни Альцгеймера 1. Число SAC компоненты, такие как Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Род и Aurora B киназы были определены, и все они кинетохора динамический белков 2. Опыт показывает, что кинетохора где сигнал SAC начинается. SAC премьер нормативных цель Cdc20. Cdc20 является одним из основных APC / C (P naphase romoting C или C омплекс yclosome) активаторов 3 и также кинетохора динамические белок 4-6. При активации SAC ингибирует активностьPC / C, чтобы предотвратить разрушение двух ключевых субстратов, циклин B и securin, тем самым предотвращая метафазы к анафазе переход 7,8. Точно, как сигнал SAC инициируется и собран на кинетохоры и передал на APC / C для подавления ее функции по-прежнему остается неуловимым. Дрозофилы является чрезвычайно послушный экспериментальной системы, гораздо проще и лучше понятных организма по сравнению с человека, кроме одного, который разделяет фундаментальные процессы, в общем. Это, пожалуй, один из лучших организмов для использования био-визуальных исследований в живых клетках, особенно для визуализации событий митоза, в пространстве и времени, так как раннего эмбриона идет по 13 быстрых ядерных циклов деление синхронно (8-10 минут для каждого цикла при 25 ° С) и постепенно организует ядер в одном монослое только под корой 9. Здесь я представляю био-изображений методом с использованием трансгенных Drosophila выраженияпоют GFP (зеленого флуоресцентного белка) или его вариант-целевых белков интереса и Leica TCS SP2 конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для изучения системы SAC функции мух, показывая изображение GFP слитых белков некоторых компонентов ЦОД, Cdc20 и Mad2 , в качестве примера.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos at JoVE.com

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Кинетохора где SAC инициирует его сигнал контроля митотической сегрегации сестринских хроматид. Описан способ визуализировать набор и оборот одного из кинетохора белков и ее координации с хромосомой движения<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионов с использованием лазерного сканирования Leica конфокальной системы.

Изучение митоза Checkpoint, иллюстрируя динамического поведения белков кинетохора и хромосомы движения в живых<em&gt; Drosophila</em&gt; Синцитиальный эмбрионов

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Изучение агрессии у дрозофилы (дрозофил)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

Применение Светоотверждаемый Стоматологическая смолы Клей для монтажа электродов или Микродиализ зонды в хронических опытах

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Высокое разрешение Измерение Запах-Driven Поведение в личинки дрозофилы

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Микроинъекция методы для изучения митоза в Дрозофилы Синцитиальный эмбрионов

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

В естественных условиях центрифугирования эмбрионов дрозофилы

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Вмешательство инъекций в дсРНК Drosophila Эмбрионы

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Определение белок-белковых взаимодействие в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Взрослые Главы по Tandem аффинной очистки (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

В естественных условиях Сшивание подход к Изолировать белковых комплексов С Дрозофилы Эмбрионы

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Генома белок-белковых Взаимодействие Скрининг белком-фрагментом комплементации анализа (РСА) в живых клетках

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...