Name: radioactive in situ hybridization for detecting diverse gene expression patterns in tissue
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00
Duration: 17 min 38 s
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Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri di laboratorio Jarvis che hanno migliorato il protocollo nel corso degli anni.

<ol>
	<li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain.">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li><li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization.">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li><li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners.">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li><li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor-driven+gene+expression.">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li><li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain.">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li><li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections.">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li><li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections.">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li><li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections:+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol.">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li><li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons.">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li><li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections.">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li><li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain.">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li><li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes.">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li><li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution.">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li><li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus.">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li><li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity.">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363 (2005).</li><li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds.">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li><li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+whom+the+bird+sings:+context-dependent+gene+expression.">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li><li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain:+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin.">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768 (2008).</li><li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization.">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Radioattivo ibridazione in situ di mRNA è ampiamente usato per molteplici scopi, compresi per lo studio dell&#39;organizzazione regionale tessuto, tipi di cellule, e l&#39;attività cerebrale funzionale 2-5,10,12-14. L&#39;uso successivo è sui geni la cui espressione mRNA nel cervello dipende da una maggiore attività neurale, spesso chiamati attività-dipendente geni o geni precoci immediati. Con questi usi, il nostro metodo è stato applicato tra le specie più, anche in uccelli, mammiferi (ad esempio umano), pesci e anfibi, in diversi tessuti, compreso il cervello, pelle e muscoli, ed età diversi, tra cui hatchlings / neonati, minori , gli adulti, e qui nelle sezioni embrioni interi 2,3,5,15-17. Le caratteristiche speciali del nostro protocollo sono: (1) produce un equilibrio tra specificità anatomica e specificità quantitativa. Per quantificare l&#39;espressione del gene sul x-ray film, scattare foto digitali delle immagini (es:. Fig. 1A e 1B), utilizzare il Photoshop (Adobe) funzione istogramma per misurare la densità di pixel nelle regioni di interesse e sottrarre i livelli di fondo del film al di fuori del tessuto, ma ancora sul vetrino 2,4. Per quantificare l&#39;espressione a livello cellulare, prendiamo immagini di granuli di argento su cellule in alto ingrandimento (40-100X; Fig. 4). Abbiamo quindi utilizzare la soglia e le funzioni di misura J Immagine Wayne Rasband a NIH per contare il numero di granuli di argento nell&#39;immagine, sottrarre il conteggio di fondo in una zona simile senza cellule sul vetrino, dividere per il numero di celle, per ottenere un valore di espressione per cella. 4,18 (2) può essere velocità relativamente elevata, permettendo l&#39;elaborazione di 100-200 diapositive simultaneamente, a causa della tenuta coverslip tenuta creata dal bagno d&#39;olio minerale. Standard in-situ di ibridazione metodi di richiedere più tempo per sigillare i vetrini con parafilm, smalto, ed altri mezzi, dove scorre prendono un sacco di spazio, (3) E &#39;moltosensibile per trascritti poco abbondanti a causa di destrano solfato e la soluzione di Denhardt nel tampone di ibridazione 2,13; (4) L&#39;approccio di imaging in campo scuro produce immagini ad alto contrasto a causa fotografare sotto illuminazione a campo scuro un microscopio da dissezione 4,5. Inoltre, permette di rivelazione sensibile piccoli cambiamenti nell&#39;espressione genica, come in attività dipendente espressione genica per identificare regioni specifiche del cervello attivate durante la percezione e la produzione di specifici comportamenti 19. Le limitazioni relative non radioattivi sono protocolli che questi ultimi sono più chiare nella risoluzione cellulare e la posizione del mRNA all&#39;interno della cellula, e lavorando con emulsione è molto sensibile alla manipolazione e alla luce. È possibile combinare il nostro metodo con altri metodi, come la non-radioattivo ibridazione in situ per etichettare l&#39;espressione mRNA di più di un gene nel tessuto stesso 10,17,20. Esso può essere combinato con l&#39;immunocitochimicaetichettare sia RNA e proteica sullo stesso campione al fine di localizzare la co-mRNA con certi tipi di cellule 10. Le modifiche necessarie per il protocollo tali esperimenti doppia marcatura sono descritti nei riferimenti citati. In sintesi, il nostro approccio facilita la comprensione dei tempi e localizzazione cellulare di espressione genica, al fine di comprendere l&#39;organizzazione regione, l&#39;attività funzionale dei tessuti, e la funzione del gene.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Anidride acetica </td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td> Viola acetato cresolo </td><td> Sigma </td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Thermo Scientific </td><td> Microm HM550 </td><td></td></tr><tr><td> Formammide deionizzata </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Promega </td><td> P1171 </td><td> 100mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td> Incorporare stampo </td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td> Fisher marchio Superfrost più scorrevole </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-034-979 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Formaldeide </td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td> Formammide </td><td> Sigma </td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> GeneClean kit </td><td> Q-Bio gene </td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak BioMax MR cinema </td><td> Sigma </td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak NTB Emulsione </td><td> Carestream Health </td><td> 8895666 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional developer D19 </td><td> Kodak </td><td> 1462593 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional Fixer </td><td> Kodak </td><td> 1971746 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Olio minerale </td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Sigma </td><td> 76240 </td><td></td></tr><tr><td> Poly A </td><td> Invitrogen </td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> RATP </td><td> Promega </td><td> P1132 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> rCTP </td><td> Promega </td><td> P1142 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> rGTP </td><td> Promega </td><td> P1152 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td> PerkinElmer </td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Solve soluzione </td><td> Sicurezza Risolvere Research Products International </td><td> 111177 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato di sodio </td><td> Sigma </td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio bibasico </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio fosfato monobasico </td><td> Sigma </td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6RNA polimerasi </td><td> Promega </td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td> Colorazione telaio metallico </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 70312-54 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasi </td><td> Promega </td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek ottobre </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Trascrizione del buffer 5x </td><td> Promega </td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td> Trietanolammina </td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl (1 M, pH 8,0) </td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Roche </td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table> Soluzioni: <ol><li> Reagenti per la produzione di ribosonde: 1,5 microlitri modello DNA (0.2-0.3 mg / pl), 2 microlitri di tampone 5x trascrizione ottimizzato, 1 ml di DTT 100mm (viene fornito con Polymerase da Promega, mixbene a temperatura ambiente), 0,3 pl di RNasin (40 unità / mL), 1,5 pl di soluzione di miscela AGC ribonucleotide, 3,5 pl di S 35 UTP, e 1 pl RNA polimerasi. Portare a 10 ml con acqua priva di nucleasi. </li><li> AGC mix soluzione ribonucleotide: miscelare la stessa quantità di 10mM ATP, GTP e CTP insieme. </li><li> Soluzione di sodio acetato per EtOH precipitazione per rimuovere libera S 35 UTP: 40 microlitri e acqua RNase DNase free, 5 pl di acetato di sodio 3M, e 125 microlitri di EtOH al 100%. </li><li> Ibridazione tampone (10 ml stock): 5 ml del 100% formammide deionizzata, 600 pl di 5M NaCl, 1M Tris-HCl (pH = 8,0), 240 pl di 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 100 pl di soluzione di Denhart 100x, 100 pl di 1M DTT, 250 pl di 20mg/ml tRNA, 125 pl di 20 mg / ml di poli A, e 1 g di solfato di sodio destrano. Aggiungere acqua trattata con DEPC per portare il volume totale di 10 ml. Agitare vigorosamente e incubare a 55 ° C fino a quando tutti destrano solfato di sodio viene sciolto. Conservare il tampone di ibridazione in-20 ° C, che è buono per ~ 6 mesi. </li><li> 4% soluzione di paraformaldeide tamponata: Aggiungere 40 g di paraformaldeide in 760 ml di acqua distillata in un pallone designato per paraformaldeide, il calore a 50 ° C su una piastra bollente sotto agitazione. Aggiungere 320 microlitri di NaOH 10N per sciogliere il paraformaldeide. Dopo aver dissolto (~ 10 min), aggiungere 100 ml di PBS 10x, e portare il volume al massimo con acqua distillata fino a 1 litro. Mescolare e riscaldare la soluzione fino a quando paraformaldeide si scioglie. Il pH dovrebbe essere 7.4. </li><li> L&#39;acetilazione tampone: 13,6 ml di trietanolammina più 2,52 ml di anidride acetica in 1 litro di acqua distillata. </li><li> 20x SSPE soluzione: 3M NaCl, 200 mM NaH 2 PO 4-H 2 O, e 200 mM EDTA in acqua distillata. Regolare la soluzione a pH 7,4 con NaOH 10N. </li><li> 10x tampone PBS: 80 g di NaCl, 2,0 g di KCl, 14.4g di Na 2 HPO 4, e 2,4 g di KH 2 PO 4 in acqua distillata. Regolare la soluzione a pH 7,0 e portare il volume totale a 1 liter. </li><li> Soluzione secondo lavaggio: 0,1% β-mercaptoetanolo e 50% formammide a 2x SSPE </li><li> Cresolo acetato soluzione viola: 3% acetato violetto cresolo in acqua di rubinetto (acqua distillata impedisce una buona colorazione), disciolto notte con agitazione in un pallone a temperatura ambiente. Filtrare con aspirazione a vuoto attraverso un filtro di carta Whatman 1 millimetro e imbuto Buchner. </li></ol>

radioactive in situ hybridization for detecting diverse gene expression patterns in tissue

Conoscendo il tempo, livello, localizzazione cellulare, e tipo di cellula che un gene viene espresso in contribuisce alla nostra comprensione della funzione del gene. Ciascuna di queste caratteristiche può essere realizzato con ibridazione in situ di mRNA all&#39;interno delle cellule. Qui vi presentiamo un metodo radioattivo in ibridazione in situ modificato da Clayton et al. (1988) 1, che opera con successo nel nostro laboratorio da molti anni, soprattutto per adulti cervelli vertebrati 2-5. Le lunghe RNA complementari (cRNA) sonde alla sequenza bersaglio permette di individuare trascritti poco abbondanti 6,7. L&#39;incorporazione di nucleotidi radioattivi nelle sonde cRNA consente di sensibilità di rivelazione ulteriore trascrizioni poco abbondanti e analisi quantitative, sia dalla luce sensibile alla pellicola a raggi X o emulsione rivestita sul tessuto. Questi metodi di rilevamento forniscono un lungo periodo di registrazione di espressione del gene bersaglio. Rispetto ai non-probe radioattivo methods, come DIG-etichettatura, il metodo di ibridazione della sonda radioattiva non richiede fasi di amplificazione multipli utilizzando HRP-anticorpi e / o TSA kit per rilevare trascritti poco abbondanti. Pertanto, questo metodo fornisce una relazione lineare fra l&#39;intensità del segnale e la quantità di mRNA bersaglio per l&#39;analisi quantitativa. Esso consente l&#39;elaborazione 100-200 vetrini simultaneamente. Funziona bene per varie fasi di sviluppo di embrioni. Maggior parte degli studi di sviluppo di espressione genica utilizzare gli embrioni interi e non-radioattivi approcci 8,9, in parte perché il tessuto embrionale è più fragile tessuto adulto, con meno della coesione tra le cellule, il che rende difficile vedere confini tra popolazioni di cellule con sezioni di tessuto. Al contrario, il nostro approccio radioattivo, a causa della più ampia gamma di sensibilità, è in grado di ottenere una maggiore risoluzione di contrasto in genica tra le regioni di tessuto, rendendo più facile vedere confini tra le popolazioni. Usando questo metodo, i ricercatori potrebbero rivelare lapossibile significato di un gene appena identificato, e ulteriormente prevedere la funzione del gene di interesse.

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Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Questo protocollo è utilizzato con successo per rilevare quantitativamente i livelli e dei modelli spaziali di espressione di mRNA in diversi tipi di tessuto in tutta specie di vertebrati. Il metodo può rilevare trascrizioni poco abbondanti e permette l&#39;elaborazione di centinaia di diapositive simultaneamente. Vi presentiamo questo protocollo con profilo di espressione di aviaria formazione del cervello dell&#39;embrione come esempio.

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