Name: radioactive in situ hybridization for detecting diverse gene expression patterns in tissue
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00
Duration: 17 min 38 s
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著者らは、年間でプロトコルを改善し、すべてのジャーヴィスラボのメンバーに感謝したいと思います。

<ol>
	<li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain.">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li><li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization.">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li><li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners.">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li><li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor-driven+gene+expression.">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li><li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain.">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li><li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections.">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li><li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections.">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li><li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections:+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol.">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li><li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons.">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li><li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections.">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li><li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain.">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li><li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes.">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li><li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution.">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li><li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus.">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li><li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity.">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363 (2005).</li><li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds.">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li><li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+whom+the+bird+sings:+context-dependent+gene+expression.">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li><li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain:+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin.">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768 (2008).</li><li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization.">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

mRNA発現のin situハイブリダイゼーション放射性は広く、地域組織の組織、細胞の種類、脳機能活性2-5,10,12-14を研究するためなど、複数の目的に使用されています。後で使用するためには、そのmRNA発現、脳内の神経活動の増加、頻繁に呼び出さ活​​動依存的遺伝子または即時早期遺伝子に依存している遺伝子にあります。孵化/新生児、少年を含む、複数の年齢、複数の組織で、脳、皮膚、筋肉を含む。これらの用途で、我々の方法は、哺乳動物（例えばヒト）、魚、両生類、鳥類を含め、複数種を越えて適用されています、成人、ここで全体の胚セクションの2,3,5,15-17。我々のプロトコルの特殊な機能が含まれます：（1）は、解剖学的特異性と定量的な特異性のバランスを生成します。 X線フィルム上に遺伝子発現を定量化するために、我々は画像のデジタル写真を撮ること（例：図1Aおよび1B）、フォーを使用しtoshop（アドビシステムズ社）の関心領域内のピクセル密度を測定し、組織の外膜の上にバックグラウンドレベルを減算するヒストグラム機能はまだスライドガラス2,4に。細胞レベルでの発現を定量するために、我々は高倍率下での細胞（ 図4】40-100X）を介して銀粒子の画像を撮影する。我々は、その後スライドガラス上の細胞なしで同じような領域でのバックグラウンドのカウントを減算し、画像内の銀粒子の数をカウントするためにNIHでのWayne Rasbandによる画像Jのしきい値および測定機能を使用して、セルの数で割るセル当たりの式の値。4,18を取得する（2）が原因鉱物油浴によって作成されたタイトなカバースリップのシールに、同時に100から200スライドの処理を可能にする、相対的に高いスループットをすることができます。標準のin-situハイブリダイゼーション法では、パラフィルム、マニキュア、スライドは多くのスペースを取る他の手段で、スライドを封止するために時間がかかる、（3）これは非常にあるデキストラン硫酸とハイブリダイゼーション緩衝液2,13でデンハルト溶液による低濃度の転写産物の高感度（4）暗視野の撮像手法は、4,5解剖顕微鏡に暗視野照明の下で写真を撮るために、コントラストの高い画像が得られます。さらに、このような活動依存的遺伝子発現のように、遺伝子発現の小さな変化の高感度な検出が特定の行動を19の知覚と生成の間にアクティブに特定の脳領域を識別することができます。非放射性プロトコルへの相対的な制限が、後者は携帯電話の解像度と、細胞内のmRNAの場所に明確であることであり、エマルジョンでの作業は、操作や光に対して非常に敏感です。同じ組織10,17,20で複数の遺伝子のmRNA発現にラベルを付けるためにin situハイブリダイゼーションなどの非放射性として、他の方法と手法を組み合わせることができます。それは免疫細胞化学と組み合わせることができます特定の細胞型10との共局在mRNAにために、同じサンプルにRNAとタンパク質の発現の両方にラベルを付けます。このような二重標識実験のために必要なプロトコルの変更は、引用文献に記載されています。 要約すると、我々のアプローチは、地域組織、組織の機能活性、遺伝子機能を理解するためにタイミングと遺伝子発現の細胞の位置の理解を容易にします。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td>クレシルバイオレット酢酸</td><td>シグマ</td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>マイクロモルHM550 </td><td></td></tr><tr><td>脱イオン化ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td>プロメガ</td><td> P1171 </td><td> 100mMの</td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマ</td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td>埋め込み型</td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドSuperfrostプラススラ​​イド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 22-034-979 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> GENECLEANキット</td><td> Q-バイオ遺伝子</td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td>コダックバイオマックスMRフィルム</td><td>シグマ</td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td>コダックNTBエマルジョン</td><td>ケアストリームヘルス社</td><td> 8895666 </td><td></td></tr><tr><td>コダックプロフェッショナル開発者D19 </td><td>コダック</td><td> 1462593 </td><td></td></tr><tr><td>コダックプロフェッショナルフィクサー</td><td>コダック</td><td> 1971746 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>カルビオケム</td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td>鉱油</td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOHで</td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> 76240 </td><td></td></tr><tr><td>ポリ</td><td>インビトロジェン</td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> RATP </td><td>プロメガ</td><td> P1132 </td><td> 10mMの</td></tr><tr><td> rCTP </td><td>プロメガ</td><td> P1142 </td><td> 10mMの</td></tr><tr><td> rGTP </td><td>プロメガ</td><td> P1152 </td><td> 10mMの</td></tr><tr><td> RNasin </td><td>プロメガ</td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td>パーキンエルマー</td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td>安全解決ソリューション</td><td>安全性は、研究プロダクツ国際を解決する</td><td> 111177 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基</td><td>シグマ</td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム一塩基性リン</td><td>シグマ</td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6RNAポリメラーゼ</td><td>プロメガ</td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td>メタルラックを染色</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 70312から54 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ</td><td>プロメガ</td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td>組織テック10月</td><td>桜</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 5倍の転写バッファー</td><td>プロメガ</td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td>トリエタノールアミン</td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td>トリス-HCl（1M、pH8.0）に</td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNAの</td><td>ロシュ社</td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table>ソリューション： <ol><li>リボプローブを作るための試薬：1.5μlのDNAテンプレート（0.2から0.3μg/μLの）、5最適化された転写緩衝液2μl、100mMのDTT 1μlの（Promegaからポリメラーゼが付属しており、ミックスよく室温）、RNasin（40ユニット/μl）、AGCリボヌクレオチド混合液を、S 35 UTPの3.5μlを、1μlのRNAポリメラーゼ1.5μlを0.3μL。ヌクレアーゼ·フリー水10μlに起動します。 </li><li> AGCリボヌクレオチド混合液：ミックス一緒に10mMのATP、GTPとCTPの等量。 </li><li>フリーS 35 UTPを削除するエタノール沈殿用酢酸ナトリウム溶液：40μlのRNaseおよびDNaseフリー水、3M酢酸ナトリウム5μlの、100％エタノール125μlの。 </li><li>ハイブリダイゼーション緩衝液（10ミリリットル株）：100％脱イオンホルムアミド5mlの、5M NaClを600μlの、1Mトリス塩酸液（pH = 8.0）、0.5M EDTA 240液（pH = 8.0）、100×デンハルトの溶液100μl、 1M DTT 100μlの、20mg/ml tRNAの250μlの20 mg / mlのポリと、デキストラン硫酸ナトリウム1gを125μlの。 10ミリリットルの合計体積をもたらすためにDEPC処理水を追加します。激しく振とうして、すべてのデキストラン硫酸ナトリウムが溶解するまで55℃でインキュベートする。にハイブリダイゼーションバッファーを格納する〜6ヶ月に適しています-20°C、。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド緩衝溶液：ホルムアルデヒド用に指定され、50〜ヒート°Cのホットプレート上で撹拌しながらフラスコ内で760ミリリットルの蒸留水にホルムアルデヒドの40グラムを追加します。パラホルムアルデヒドを溶解するのを助けるために10NのNaOH 320μlを添加します。 （〜10分）に溶解した後、10倍のPBS 100ミリリットルを追加し、1リットルになるまで蒸留水を使用してボリュームを起動します。ホルムアルデヒドが溶解するまで溶液を攪拌し、加熱する。 pHは7.4でなければなりません。 </li><li>アセチル化バッファー：トリエタノールアミン13.6ミリリットルを加え、蒸留水1リットル中の無水酢酸の2.52ミリリットル。 </li><li> 20×SSPE溶液：3MのNaCl、200mMののNaH 2 PO 4-H 2 O、および蒸留水で200 mMのEDTA。 10N NaOHでpH7.4に解決策を調整します。 </li><li> 10×PBS緩衝液：蒸留水のKH 2 PO 4のNaClの80グラム、KClの2.0グラム、14.4グラムのNa 2 HPO 4、2.4グラム。 pHを7.0にソリューションを調整し、1 Liteに総量をもたらすR。 </li><li>第二洗浄液：0.1％β-メルカプトエタノールおよび2x SSPEで50％のホルムアミド</li><li>クレシルバイオレット酢酸溶液：水道水の3％クレシルバイオレット酢酸（蒸留水が良い染色を防ぎます）、室温でフラスコ内を撹拌しながら一晩溶解した。 1ミリメートルワットマン濾紙とブフナー漏斗を介して真空吸引してフィルタリングします。 </li></ol>

radioactive in situ hybridization for detecting diverse gene expression patterns in tissue

遺伝子は、遺伝子の機能の理解に貢献するで表現されているタイミング、レベル、細胞内局在、細胞の種類を知っている。これらの各機能は、細胞内のmRNAのin situハイブリダイゼーションを行うことができます。ここでは、クレイトンら （1988）1特に大人の脊椎動物の脳2-5、長年にわたって私たちのラボで正常に働いているから修正in situハイブリダイゼーション法で放射性を提示する。標的配列への長い相補的RNA（cRNA）をプローブは、低濃度の転写産物6,7の検出を可能にします。 cRNAプローブに放射性ヌクレオチドの取り込みのいずれかの組織の上にコーティングされた光に敏感なX線フィルム又はエマルジョンにより、低濃度の転写産物と定量分析の更なる検出感度を可能にします。これらの検出方法は、標的遺伝子の発現の長期的な記録を提供しています。非放射性プローブ​​をメタに比べてそのようなDIG標識としてODS、放射性プローブ​​のハイブリダイゼーション法は、低濃度の転写産物を検出するためにHRP-抗体および/またはTSAキットを使用して複数の増幅工程を必要としません。したがって、このメソッドは、定量分析のための信号強度と標的mRNAの量の間の線形関係を提供しています。それは同時に100から200までのスライドを処理することができます。それは胚の発達段階の異なるにも適しています。胚組織は、それが困難な組織切片を持つ細胞集団間の境界を確認しながら、細胞間の少ない凝集して、成体組織よりも脆弱であるため、ほとんどの遺伝子発現の発達研究では、全体の胚および一部の非放射性のアプローチ8,9を使用しています 。対照的に、感度のより広い範囲のために私たちの放射性アプローチは、それが簡単に集団間の境界を見て作り、組織領域間の遺伝子発現の解像度で高コントラストを得ることができる。この方法を使用して、研究者は明らかにすることができ新たに同定された遺伝子の可能性の意義、さらに興味のある遺伝子の機能を予測する。

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Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

このプロトコルが正常に定量的な脊椎動物種間で複数の組織の種類のレベルとmRNA発現の空間パターンを検出するために使用されています。メソッドは、低濃度の転写物を検出すると同時にスライドの何百もの処理を可能にすることができます。我々は、例として、鳥類の胚の脳形成の発現プロファイリングを使用して、このプロトコルを提示します。

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Research

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Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

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