Name: radioactive in situ hybridization for detecting diverse gene expression patterns in tissue
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00
Duration: 17 min 38 s
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Os autores gostariam de agradecer a todos os membros Jarvis laboratório que melhoraram o protocolo ao longo dos anos.

<ol>
	<li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain.">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li><li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization.">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li><li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners.">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li><li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor-driven+gene+expression.">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li><li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain.">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li><li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections.">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li><li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections.">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li><li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections:+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol.">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li><li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons.">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li><li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections.">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li><li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain.">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li><li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes.">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li><li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution.">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li><li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus.">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li><li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity.">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363 (2005).</li><li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds.">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li><li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+whom+the+bird+sings:+context-dependent+gene+expression.">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li><li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain:+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin.">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768 (2008).</li><li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization.">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Radioactivos hibridação in situ da expressão do mRNA é amplamente utilizado para fins múltiplos, incluindo para estudar organização do tecido regional, tipos de células, e actividade funcional do cérebro 2-5,10,12-14. O uso mais tarde está em genes cuja expressão de mRNA no cérebro é dependente da atividade neural maior, muitas vezes chamado de atividade dependentes de genes ou genes imediatos iniciais. Com estas utilizações, o nosso método foi aplicado em várias espécies múltiplas, incluindo, em aves, mamíferos (por exemplo, humanos), peixes e anfíbios; em múltiplos tecidos, incluindo o cérebro, pele, músculo e; e idades múltiplas, incluindo hatchlings / recém-nascidos, juvenis , os adultos, e aqui em seções inteiras de embriões 2,3,5,15-17. As características especiais do nosso protocolo incluem: (1) Ela produz um equilíbrio entre a especificidade anatômica e especificidade quantitativa. Para quantificar a expressão gênica no filme de raios-x, tiramos fotos digitais das imagens (ex:. Figura 1A e 1B), use o Photoshop função de histograma (Adobe) para medir a densidade de pixels nas regiões de interesse e subtrair os níveis de fundo sobre o filme exterior do tecido, mas ainda na lâmina de vidro 2,4. Para quantificar a expressão a nível celular, tomamos imagens de grãos de prata sobre as células sob ampliação elevada (40-100X; Fig. 4). Em seguida, usamos o limiar e medindo funções de J Imagem por Wayne Rasband no NIH para contar o número de grãos de prata na imagem, subtrair a contagem de fundo em uma área similar sem células sobre a lâmina de vidro, dividir pelo número de células, para obter um valor de expressão por célula. 4,18 (2) Pode ser rendimento relativamente elevado, permitindo o processamento de 100-200 lâminas simultaneamente, devido à vedação lamela apertado criado pelo banho de óleo mineral. Métodos padrão de hibridização in-situ demorar mais tempo para selar as lâminas com parafilme, unha polonês, e outros meios, onde lâminas ocupam muito espaço, (3) É altamentesensível para as transcrições baixa abundância devido ao sulfato de dextrano e solução de Denhardt no tampão de hibridação 2,13, (4) A abordagem de imagem em campo escuro produz imagens de alto contraste devido a fotografar sob iluminação de campo escuro sobre um microscópio de dissecação 4,5. Além disso, permite a detecção sensível de pequenas alterações na expressão do gene, tais como na actividade dependente da expressão do gene para identificar regiões específicas do cérebro activadas durante a percepção e produção de comportamentos específicos 19. As limitações em relação ao não-radioactivos protocolos são que estas últimas são mais clara na resolução celular e da localização do mRNA no interior da célula, e trabalhando com a emulsão é muito sensível à manipulação e da luz. É possível combinar o nosso método com outros métodos, tais como não radioactivo em hibridização in situ para rótulo de expressão de mRNA de mais de um gene no mesmo tecido 10,17,20. Ele pode ser combinado com imunocitoquímicapara rotular RNA e expressão da proteína sobre a mesma amostra, a fim de co-localizar o ARNm com certos tipos de células 10. As modificações protocolo necessário para tais experiências dupla marcação são descritas nas referências citadas. Em resumo, a nossa abordagem facilita a compreensão do tempo e localização celular da expressão do gene, a fim de entender organização região, a atividade do tecido funcional e da função do gene.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Anidrido acético </td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de cresil violeta </td><td> Sigma </td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Thermo Scientific </td><td> Microm HM550 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida deionizada </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> Promega </td><td> P1171 </td><td> 100mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td> Incorporação de molde </td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td> Fisher marca Superfrost mais slides </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-034-979 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Formaldeído </td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Sigma </td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> GENECLEAN kit </td><td> Q-Bio gene </td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak BioMax MR filme </td><td> Sigma </td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak NTB Emulsão </td><td> A Carestream Health </td><td> 8895666 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional desenvolvedor D19 </td><td> Câmera fotográfica </td><td> 1462593 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak profissional Fixer </td><td> Câmera fotográfica </td><td> 1971746 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Sigma </td><td> 76240 </td><td></td></tr><tr><td> Poli A </td><td> Invitrogen </td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> rATP </td><td> Promega </td><td> P1132 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> RCTP </td><td> Promega </td><td> P1142 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> rGTP </td><td> Promega </td><td> P1152 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td> PerkinElmer </td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Solve solução </td><td> Segurança Resolva Research Products International </td><td> 111177 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de Sódio </td><td> Sigma </td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sódio monobásico </td><td> Sigma </td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6RNA polimerase </td><td> Promega </td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td> Coloração prateleira de metal </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 70312-54 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerase </td><td> Promega </td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek outubro </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Transcrição tampão 5x </td><td> Promega </td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td> Trietanolamina </td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl (1 M, pH 8,0) </td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Roche </td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table> Soluções: <ol><li> Reagentes para fazer de riboprobes: 1,5 modelo DNA ul (0,2-0,3 mg / mL), 2 ul de tampão de transcrição 5x otimizado, 1 ml de DTT 100mM (vem com Polimerase de Promega, mixbem à temperatura ambiente), 0,3 ul de RNasin (40 unidades / uL), 1,5 ul de solução de AGC mistura ribonucleótido, 3,5 ul de S 35 UTP, e uma polimerase de ARN uL. Traga até 10 ul com nuclease livre de água. </li><li> AGC solução mix ribonucleotídeo: misture quantidades iguais de 10 mM ATP, GTP e CTP juntos. </li><li> Solução de acetato de sódio para EtOH precipitação para remover 35 S livre UTP: 40 ul de ARNase e ADNase água livre, 5 ul de acetato de sódio 3M, e 125 uL de EtOH a 100%. </li><li> Tampão de hibridação (10 mL de stock): 5 ml de 100% de formamida desionizada, 600 ul de NaCl 5M, 1M Tris-HCl (pH = 8,0), 240 ul de EDTA 0,5 M (pH = 8,0), 100 uL de solução de Denhart 100x, o 100 ul de 1M de DTT, 250 uL de 20mg/ml tRNA, 125 uL de 20 mg / ml de poli A, e 1 g de sulfato de sódio dextrano. Adicionar DEPC tratada com água para levar o volume total para 10 ml. Agita-se vigorosamente e depois incubar a 55 ° C até que todo o sulfato de sódio dextrano é dissolvido. Armazenar o tampão de hibridação em-20 ° C, que é bom para ~ 6 meses. </li><li> 4% tamponado solução de paraformaldeído: Adicionar 40 g de paraformaldeído em 760 ml de água destilada em um balão de designado para paraformaldeído, o calor a 50 ° C sobre uma placa quente com agitação. Adicionar 320 uL de NaOH 10N para ajudar a dissolver o paraformaldeído. Depois de se dissolver (~ 10 min), adicionar 100 ml de PBS 10x, e trazer o volume com água destilada até 1 litro. Agita-se e aquecer a solução até paraformaldeído é dissolvido. O pH deve ser de 7,4. </li><li> Tampão de acetilação: 13,6 ml de trietanolamina, mais 2,52 ml de anidrido acético em 1 litro de água destilada. </li><li> 20x SSPE solução: 3M NaCl, 200 mM de NaH 2 PO 4-H2O, e 200 mM de EDTA em água destilada. Ajuste a solução para pH 7,4 com NaOH 10N. </li><li> 10x tampão PBS: 80g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, e 2,4 g de KH PO 2 4 em água destilada. Ajuste a solução a pH 7,0 e trazer o volume total a 1 Liter. </li><li> Solução de lavagem segundo: 0,1% β-mercaptoetanol e formamida a 50% em 2x SSPE </li><li> Solução de acetato de cresilo violeta: acetato de violeta de cresilo 3% em água da torneira (água destilada impede coloração bom), dissolvido durante a noite, com agitação num balão à temperatura ambiente. Filtrar por sucção a vácuo através de um Whatman 1 milímetro filtro de papel e um funil de Buchner. </li></ol>

radioactive in situ hybridization for detecting diverse gene expression patterns in tissue

Sabendo o tempo, o nível, a localização celular, e tipo de célula que um gene é expresso em contribui para a nossa compreensão da função do gene. Cada uma destas características pode ser realizado com a hibridização in situ para mRNAs dentro das células. Aqui apresentamos uma radioativo no método de hibridização in situ modificado de Clayton et al. (1988) 1 que tem trabalhado com sucesso em nosso laboratório por muitos anos, especialmente para adultos cérebros vertebrados 2-5. Os longos complementares de RNA (cRNA) sondas com a sequência alvo permite a detecção de transcritos baixa abundância 6,7. Incorporação de nucleótidos radioactivos para as sondas crna permite ainda mais a sensibilidade de detecção de transcritos baixa abundância e análises quantitativas, quer pela luz filme de raios-X sensível ou emulsão revestido sobre o tecido. Estes métodos de detecção de fornecer um registo de longo prazo da expressão do gene alvo. Em comparação com os não-radioativo sonda methODS, tais como DIG-rotulagem, o método de hibridação da sonda radioactiva não requer passos de amplificação múltiplas usando HRP-anticorpos e / ou TSA kit para detectar transcritos baixa abundância. Portanto, este método proporciona uma relação linear entre a intensidade do sinal e quantidades de mRNA-alvo para a análise quantitativa. Ele permite o processamento simultâneo 100-200 lâminas. Ele funciona bem para diferentes estágios de desenvolvimento de embriões. A maioria dos estudos de desenvolvimento de expressão do gene utilizar embriões inteiros e não radioactivos abordagens 8,9, em parte porque o tecido embrionário é mais frágil do tecido adulto, com menos de coesão entre as células, tornando-a difícil de ver os limites entre as populações de células com secções de tecido. Em contraste, a nossa abordagem radioactivos, devido à maior gama de sensibilidade, é capaz de obter maior contraste na resolução da expressão do gene entre as regiões de tecido, tornando-o mais fácil de ver os limites entre as populações. Usando este método, os pesquisadores poderiam revelar apossível significado de um gene recentemente identificado, e ainda prever a função do gene de interesse.

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Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Este protocolo é usado com sucesso para detectar quantitativamente os níveis e padrões espaciais de expressão de mRNA em vários tipos de tecido em todas as espécies de vertebrados. O método pode detectar transcritos baixa abundância e permite o tratamento de centenas de lâminas simultaneamente. Apresentamos este protocolo com perfil de expressão de formação cérebro das aves embrionárias como um exemplo.

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