Name: profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور غريغ مارتن (جامعة كورنيل) وجماعته لتوفير سلالة DC3000، وبذور الطماطم، وتقديم المشورة. وهم يودون أيضا أن أشكر الدكتور تشونغ لين مذكرة تفاهم للمساعدة في بروتوكول DAB وشعبة البروتيوميات في مركز الجبهة المتحدة المتعدد التخصصات للبحوث التكنولوجيا الحيوية للحصول على المساعدة في تطوير أسلوب. تم تعديل بروتوكول لاستخراج البروتين من Hurkman وتاناكا 16. تم تعديل بروتوكول بشأن وضع العلامات cysTMT، الخطوات من 4 إلى 6 على أساس المنتج الأصلي بيرس الحرارية العلمية فيشر دليل 17. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (MCB 0818051 لتشن S).

<ol>
	<li>Almeida, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).</li><li>Preiter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+virulence+gene+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+strain+DC3000.">Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000.</a> J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).</li><li>Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+of+an+oxidative+burst+during+elicitation+of+cultured+plant+cells:+role+in+defense+and+signal+transduction.">Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction.</a> Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).</li><li>Orozco-Cardenas, M., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+is+generated+systemically+in+plant+leaves+by+wounding+and+systemin+via+the+octadecanoid+pathway.">Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6553-6557 (1999).</li><li>Tonks, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+redux:+revisiting+PTPs+and+the+control+of+cell+signaling.">Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling.</a> Cell. 121, 667-670 (2005).</li><li>Alvarez, S., Wilson, G. H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+disulfide-bonded+proteins+in+Arabidopsis.">Determination of in vivo disulfide-bonded proteins in Arabidopsis.</a> J. Chromatogr. B. 877, 101-104 (2009).</li><li>Apel, K., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species:+metabolism,+oxidative+stress,+and+signal+transduction.">Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 55, 373-399 (2004).</li><li>Dayon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+proteins+in+human+cerebrospinal+fluids+by+MS/MS+using+6-+plex+isobaric+tags.">Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6- plex isobaric tags.</a> Anal. Chem. 80, 2921-2931 (2008).</li><li>Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cysteine-reactive+tandem+mass+tag+reagent+for+subproteome+labeling,+enrichment+and+quantitation.">A novel cysteine-reactive tandem mass tag reagent for subproteome labeling, enrichment and quantitation.</a> , TP169 (2010).</li><li>Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+Arabidopsis+mutants:+diaminobenzidine+stain+for+hydrogen+peroxide.">Phenotypic analysis of Arabidopsis mutants: diaminobenzidine stain for hydrogen peroxide.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).</li><li>Sethuraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-Coded+affinity+tag+(ICAT)+approach+to+redox+proteomics:+identification+and+quantification+of+oxidant-sensitive+cysteine+thiols+in+complex+protein+mixtures.">Isotope-Coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: identification and quantification of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures.</a> J. Proteome Res. 3, 1228-1233 (2004).</li><li>Asso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+and+redox+characterization+of+ferredoxins+I+and+II+from+Desulfovibrio+vulgaris+Miyazaki.">EPR and redox characterization of ferredoxins I and II from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 198-204 (1995).</li><li>Huang, H. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+resistance+to+bacterial+pathogens+affected+by+the+amount+of+ferredoxin-I+proteins+in+plants.">Disease resistance to bacterial pathogens affected by the amount of ferredoxin-I proteins in plants.</a> Mol. Plant Pathol. 8, 129-137 (2007).</li><li>Hurkman, W., Tanaka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+plant+membrane+proteins+for+analysis+by+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis.</a> Plant Physiol. 81, 802-806 (1986).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا البروتوكول يوفر معلومات عن أداء تلطيخ DAB، فضلا عن cysTMT المسمى الكمي السيستين الأكسدة. هذه الإجراءات هي مفيدة في دراسة إنتاج ريوس، فضلا عن تأثير ذلك على تنظيم البروتينات عندما يتم تلقيح مغد lycopersicum مع syringae الزائفة. الطرق الواردة في هذا البروتوكول توفير وسيلة لفحص عينات ريوس في ورقة كاملة في الطريقة التي تسبب أقل قدر من الضرر على الأنسجة ورقة. الإجراء وضع العلامات يوفر وسيلة لفحص الأكسدة يحتمل البروتينات تنظم من خلال استخدام أسلوب وضع العلامات السيستين. هذا مفيد عند النظر في مرحلة مبكرة من الاستجابة للضغط النفسي. ويمكن استخدام أساليب مثل علامة تقارب النظائر تلوينها (ICAT) وcysTMT في دراسة إمكانية تنظيم الأكسدة البروتينات في عينات بيولوجية. ICAT يسمح وضع العلامات والمقارنة بين عينتين 12. كلا أساليب تسمية cysteines حرة ويمكن استخدامها لبروتين quantificأوجه 10،12. ومع ذلك، فإن طريقة cysTMT يسمح للانخفاض في اختلاف التجارب وكذلك الإرسال المتعدد 10. عدد العلامات المتاحة يسمح للباحثين لتشمل مكررات أو عينات متعددة في تصميمها التجريبية. وجود المزيد من عينات يوفر احتمال وجود عدد أكبر من البروتينات التي تم تحديدها. ومن المآخذ الرئيسية لتقنية cysTMT هو أنه ينال من الجودة الشاملة لتحديد بروتين بسبب الخطوات تخصيب انتقائية لcysTMT المسمى-الببتيدات (6،5-6،6). عدد الببتيدات لتحديد بروتين يعتمد بشكل كبير على عدد من بقايا السيستين في تسلسل البروتين. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق تقديم جزء من العينة تريبسيني قبل التخصيب لقياس الطيف الكتلي تحديد بروتين. نظرا لطبيعة التصميم التجريبي، وكذلك آلية وضع العلامات التي تستخدم أسلوب cysTMT، خطوات معينة حاسمة. أثناء أداء preci بروتينpitation وبيليه الغسيل (3.9) من المهم للحفاظ على عينات من الفتور على الجليد للحد من تدهور البروتين. خلال وضع العلامات cysTMT، إزالة كاشف الحد من (4.6) مهم جدا لأنه قد يتعرض لوضع العلامات عينات عكس ذلك. وضع العلامات العكس هو ممكن إذا خفض كاشف لا يزال في العينة. إذا خفضت عينات بعد وضع العلامات، يمكن إزالة العلامة cysTMT. مرة واحدة يتم إضافة تسميات للعينات، لا بد من التحقق من مستوى الرقم الهيدروجيني (4.7) من أجل الحصول على أفضل كفاءة وضع العلامات. وبالإضافة إلى ذلك، وتحليل البيانات تعتمد على ما هو مطلوب من الباحث والهدف النهائي في استخدام بروتوكول. كما أنها تعتمد على البرمجيات المستخدمة في كل برنامج لديه خوارزميات مختلفة. هذه التجربة تستخدم الممرض بوصفه elicitor لزيادة الإنتاج من الأنواع المؤكسدة رد الفعل في الطماطم، ومع ذلك، يمكن قياس غيرها من الاستجابات للوائح الأكسدة وفقا لذلك. هذا التصميم التجريبي غير قابلة للتكيف مع النباتية الأخرى والنظم الحيوانية. </P&gt;

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> MetroMix 500 </td><td> شركات مؤسسات بريتون وودز </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3،3 &#39;-Diaminobenzidine </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep عدة استخراج متسلسل الكاشف 3 </td><td> الحيوي راد </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X بروتين مقايسة </td><td> التوالد التكنولوجيا </td><td> 786-12X </td></tr><tr><td> cysTMT الكواشف </td><td> الحرارية البروتين المنتجات بيرس البحث العلمي </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmli عينة الواق </td><td> الحيوي راد </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> الحيوي الآمن Comassie (G-250 وصمة عار) </td><td> الحيوي راد </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3KD عمود </td><td> ميليبور </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> يجمد مكافحة TMT الراتنج </td><td> الحرارية البروتين المنتجات بيرس البحث العلمي </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> عمود الطرد المركزي </td><td> الحرارية البروتين المنتجات بيرس البحث العلمي </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep العمود الثاني C18 </td><td> جديد الهدف </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> بروتيوم مكتشف 1،2 البرمجيات </td><td> الحرارية البروتين المنتجات بيرس البحث العلمي </td><td></td></tr><tr><td> التربسين </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge أنبوب جهاز طرد مركزي </td><td> الحرارية العلمية Nalgeشركة الشرق الأدنى </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> أنبوب Microcentrifuge (2ml) </td><td> الولايات المتحدة الأمريكية والعلم </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12٪ مصغرة متلون TGX سابقة الصب جل </td><td> الحيوي راد </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> أعلى النموذج &gt; الحيوي الآمن Coomassie StainBottom من نموذج </td><td> الحيوي راد </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT تخصيب عدة </td><td> الحرارية البروتين المنتجات بيرس البحث العلمي </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

الزائفة syringae الكهروضوئية DC3000 السلالة. الطماطم ليس فقط يسبب مرض جرثومي بقعة في lycopersicum مغد ولكن أيضا على أنواع الكرنب، وكذلك على thaliana Arabidopsis، وهو نبات المضيف لين العريكة وراثيا 1،2. تراكم أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) في النبتات تلقيح مع DC3000 يشير إلى وجود دور للروس في تحوير موت الخلايا نخرية خلال مرض جرثومي بقعة من الطماطم 3. ويتم إنتاج بيروكسيد الهيدروجين، وهو مكون من روس، بعد تلقيح نباتات الطماطم مع الزائفة 3. ويمكن الكشف عن بيروكسيد الهيدروجين باستخدام وصمة عار 3&#39;-3 النسيجية &quot;diaminobenzidine (DAB) 4. DAB تلطيخ يتفاعل مع بيروكسيد الهيدروجين لإنتاج البني وصمة عار على ورقة 4 الأنسجة. ROS بدور تنظيمي للبيئة الأكسدة الخلوية، والتي يمكن تغيير حالة الأكسدة من بروتينات معينة 5. السيستين هو حمض أميني مهم حساسة للالأكسدة التغييرات. تحت أكسدة خفيفة، وأكسدة عكسها الجماعات السيستين سلفهيدريل بمثابة المجسات الأكسدة ومحولات الطاقة إشارة إلى أن تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات الفيزيولوجية 6،7. جنبا إلى جنب كتلة علامة (TMT) الكواشف تمكين المتزامنة وتحديد الكميات المضاعفة من البروتينات في عينات مختلفة باستخدام جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي 8،9. والسيستين التفاعل TMT (cysTMT) الكواشف تمكين وضع العلامات انتقائية والكميات النسبية للالسيستين التي تحتوي على الببتيدات من ما يصل الى ستة العينات البيولوجية. كل علامة cysTMT إسوي الضغط له نفس كتلة الأم الاسمي، وتتكون من مجموعة سلفهيدريل التفاعل، وهي ذراع هل MS-محايدة وافاد مراسل MS / MS 10. بعد وضع العلامات، وكانت العينات التي تخضع لعملية الهضم البروتيني. وقد أثرى الببتيدات السيستين المسمى باستخدام الراتنج التي تحتوي على المضادة للTMT الأجسام المضادة. خلال MS / MS تحليل، سلسلة من الأيونات مراسل (أي 126-131 دا) تنشأ في المنطقة كتلة منخفضة، وتوفير المعلومات عن الكميات النسبية.سير العمل غير فعالة للحد من تعقيد العينة، وتحسين المدى الديناميكي ودراسة التعديلات السيستين. هنا نقدم تحليل البروتين الأكسدة من الطماطم DC3000 الباسيفيكي المعالجة (ريو غراندي) يترك باستخدام تكنولوجيا cysTMT. هذا أسلوب الإنتاجية العالية لديه القدرة على أن تطبق على دراسة أخرى الأكسدة التنظيم العمليات الفيزيولوجية.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

ورفع مستوى رد الفعل أنواع الاكسجين عندما تواجه الخلايا ظروف الإجهاد. هنا نعرض على سبيل المثال من تلطيخ diaminobenzidine 3&#39;-3 &quot;فضلا عن cysTMT وضع العلامات وقياس الطيف الكتلي لمحة عن بروتيوم الأكسدة في<em&gt; الزائفة syringae</em&gt; تعامل أوراق الطماطم.

التنميط بروتيوم الأكسدة والاختزال ثيول استخدام الطيف النظائر كتلة توصيف

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

والتقييم الكمي لاستخدام الطيف Lipidome الخميرة Electrospray قداس التأين

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

أليغو التنميط قداس (OLIMP) من السكريات خارج الخلية

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

التحليل المباشر للخلايا واحدة بواسطة الطيف الكتلي في الضغط الجوي

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

التنميط وغيره من Methyltransferases S - adenosyl - L - الهموسيستين ملزم البروتينات المركبة من قبل التقاط الطيف الكتلي (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

رد الفعل المحدد رصد الطيف الكتلي لالمطلق البروتين الكمي

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

تحديد MyoD Interactome عن طريق جنبا الى جنب الانجذاب تنقية جانب لقياس الطيف الكتلي

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

الخلوية الأكسدة التنميط باستخدام عالية المحتوى المجهري

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...