Name: profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Greg Martin (Cornell University) og hans gruppe for at give DC3000 stamme, tomatfrø, og rådgivning. De vil også gerne takke Dr. Zhonglin Mou for at få hjælp med DAB-protokollen og Proteomics afdelingen UF Interdisciplinært Center for Bioteknologi Forskningscenter for bistand til metodeudvikling. Protokollen for protein ekstraktion blev ændret fra Hurkman og Tanaka 16. Protokollen om cysTMT mærkning, trin 4 til 6 blev tilpasset baseret på den oprindelige Thermo Pierce Fisher Scientific produktmanual 17. Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation (MCB 0818051 til S Chen).

1. Voksende Frøplanter og Forbereder Bakterier <ol><li> Frøplanter spirede i MetroMix 500 jordblanding (BWI ​​Companies) i et vækstkammer (160 pmol fotoner m-2s-1 med en fotoperiode på 8 timers lys ved 22 ° C og 16 timers mørke ved 20 ° C i 1 uge. Relativ fugtighed blev sat til 70%. Kimplanter blev vandet med ledningsvand efter behov for at holde jorden bliver tør. </li><li> To kimplanter af lignende størrelse derefter transplanteres til 4 &quot;diameter potter indeholdende MetroMix 500 jord og dyrket i yderligere 3 uger under de samme betingelser som 1,1. </li><li> Pseudomonas syringae (PST) indledningsvis T-udstrøget på Kings B medium (KBM) plader (pr. liter: 20 g proteose-pepton, 0,1975 g MgSO4, 1% glycerol, 1,5 g K 2 HPO 4, 18 g agar) og dyrket i to dage ved 28 ° C. En enkelt koloni opsamles, blandes i 300μl flydende Kings B medium (20 g proteose pepton, 0,1975 g MgSO4 </sub&gt; 10 ml glycerol, 10 ml 100x K 2 HPO4 lager (1,5 g K 2 HPO 4 i 10 ml H2O), og spredt på et Kings B medium plade. Dette dyrkes natten over ved 28 ° C. </li><li> Bakterierne podestof fremstilles ved at skrabe de dyrkede bakterier fra KBM pladen i 20 ml H2O En OD600 på 0,03 (ca. 10 6 cfu / ml) fremstilles i en L inokulering buffer (10 mM MgCl2 + 400 pi Silwett-70). Podning buffer minus bakterier blev forberedt til styring løsning. </li></ol> 2. Podning af tomat med Pst og H2O 2 histokemisk plet <ol><li> Fire uger gamle planterne blev podet ved neddypning i den ovennævnte inokulering opløsningen i 30 sekunder. Klare plastposer blev sat over planterne umiddelbart efter inokulering. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin (DAB) farvning 11 blev fremstillet (1 mg / ml DAB i H2O, pH 3,8 (HCl)) tre dlav e før brug for at opnå fuldstændig solubilisering. Opløsningen blev rystet for at blande ved stuetemperatur. </li><li> Fireogtyve timer efter behandlingen blev den fuldt udfoldede blade fjernes, anbringes i DAB pletten epidermale side opad, og vakuum infiltreret i 15 minutter. Bladene blev derefter sat i mørke ved stuetemperatur natten over for farvning. </li><li> Bladene blev kogt i 95% ethanol i 10 minutter og derefter opbevaret i 75% ethanol. </li></ol> 3. Proteinekstraktion <ol><li> Efter høst blev tomatblade formalet til fint pulver med flydende nitrogen under anvendelse af morter og støder. </li><li> For 0,5 g væv, og der tilsættes 1,25 ml Tris pH 8,8 bufret phenol og 1,25 ml / 0,5 g ekstraktionsbuffer (0,1 M Tris-HCI, pH 8,8, 10 mM EDTA, 0,9 M saccharose) og derefter fortsætter formaling til et par mere minutter i en stinkskab. </li><li> Overførsel af ekstrakten til Oakridge centrifugerør (Thermo Fisher Scientific Nalgene Company) og omrør i 2 timer ved stuetemperatur. </li><li> Centrifuger ved 5000 xgog 15 ° C i 10 min. Overfører den øverste phenol fase til et nyt rent rør. </li><li> Back-den vandige fase ekstraheres med samme volumen blev ekstraheret phenol puffer; omrøre på en ryster i 30 min. Centrifuger og overføre ekstrakten til en ny Falcon rør. </li><li> Gentag ovenstående trin en mere tid og ekstrakt overfoeres til nye Oakridge rør. </li><li> Udfældning phenolekstraheret proteiner ved tilsætning af 5 volumener af 0,1 M ammoniumacetat i 100% methanol (opbevaret ved -20 ° C). Vortex og inkuberes ved -20 ° C natten over. </li><li> Opsaml protein pellet ved centrifugering ved 20.000 x g, 4 ° C i 20 minutter. </li><li> Vask centrifugebundfaldet 2 gange med koldt 0,1 M ammoniumacetat i methanol og 2 gange med 80% kold acetone. Tilsættes 1,5 ml kold 70% ethanol til pelleten og suspendere. Overføres til en 2 ml mikrocentrifugerør (USA Scientific) og centrifugeres ved 14.000 opm, 4 ° C i 20 minutter. Fjerne ethanol. </li><li> Tørre pellet kortvarigt i en SpeedVac-koncentrator og opløst i et protein Udvindinghandling puffer, f.eks ReadyPrep Protein Extraction Kit reagens 3 (8 M urinstof, 4% CHAPS, 40 mM Tris-base, 2 M thiourinstof) (Bio-Rad). Centrifugeres ved 14.000 rpm og 20 ° C i 30 minutter til dannelse af en pellet. Opsamle supernatanten. </li><li> Måle proteinkoncentrationen ved hjælp af en CB-X proteinassayet ifølge producentens vejledning (Geno Technology). </li></ol> 4. Prøveforberedelse og Peptid mærkning med cysTMTs <ol><li> Fremstille protein prøve ved en koncentration på 2-5 ug / ul. Her anvendes 100 ug protein for hver masse tag, 20 ul-50 gl prøver. Til dette eksperiment alle 6 mærker blev anvendt. </li><li> Tilsættes lige så stort volumen alkylering puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 200 mM iodacetamid) til proteinprøven at blokere frie thiolgruppe. Buffer bør udarbejdes frisk. Alkyleringen udføres ved 37 ° C i 1 time. </li><li> Udfælde proteinet ved tilsætning af 1 ml kold 80% acetone ved -20 ° C natten over. Pelleten proteinet ved centrifugering ved 14.000opm, 4 ° C i 20 minutter. Vask centrifugebundfaldet 3 gange med 80% acetone hvirvelbehandling hver gang. Fjern supernatanten og lad det lufttørre mens på is. </li><li> Pellet resuspenderes i 50 pi lysisbuffer (6 M urinstof, 50 mM Tris-base, 1 mM EDTA). 0,5 pi 100 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) tilsættes derefter for at reducere disulfidbindingerne ved inkubation i en time ved stuetemperatur. </li><li> Forberede tags ved tilsætning af 20 ul af acetonitril til reagensglas at solubilisere tags. Vortex og spin ned til bunden. </li><li> Udvaske ekstra TCEP med et Microcon 3KD centrifugal filter (Millipore). Tilsættes 50 uL prøven Microcon 3KD kolonne, og 50 pi lysisbuffer til søjlen. Centrifugeres i 15 minutter ved 10.000 x g og 4 ° C. Gentag dette trin for i alt tre gange. Fjerne kolonne og inverteres i et rent rør. Centrifugeres i 5 minutter ved 1000 xg og 4 ° C. </li><li> PH kontrolleres. Hvis det er nødvendigt, justeres pH til 7,0-8,0 med 1 M HCI. </li><li> Tilsættes 5 pi af cysTMT reagens til hver prøve (Den cysTMT reagenskit giver 20 ul tags i op til 500 mg protein. Denne metode bruger 100 mikrogram protein, derfor bruger vi en femtedel af tag.). Tillade reaktionen at forløbe i 2 timer ved stuetemperatur. </li><li> Prøver blev kombineret med Laemmli prøvebuffer (Bio-Rad) i et 1:1 forhold. </li></ol> 5. Fjernelse af ikke-reagerede Tag Sample Fraktionering <ol><li> Prøverne blev kogt i 5 minutter og separeret på en forstøbt 12% polyacrylamid-gel (Bio-Rad). Gelen blev skyllet tre gange i 5 minutters intervaller med filtreret H2O og farvet med Coomassie Blue (Bio-Rad) i 1 time. Gelen blev de-farvet natten over med H2O </li><li> Tolv fraktioner blev opsamlet fra hver gelbanen. Fraktioner blev bestemt ved proteinbånd koncentrationer. Fraktionerne blev hakket i 1 mm stykker og opsamles i en 1,5 mL rør. </li><li> Gelstykker blev de farvede under anvendelse af 50% acetonitril og 0,1 M ammoniumbicarbonat i H2O </sub&gt; O. Dette trin gentages, indtil blå farve fjernes fra gelstykkerne (ca. 3-4 gange, 15 minutter hver gang). </li><li> De farvede gel stykker blev tørret ved anvendelse af 100% acetonitril (dække gelstykker) i 15 min, supernatanten blev fjernet, og stykkerne blev tørret under anvendelse af en SpeedVac. </li><li> Opløse trypsin (Promega) ved 1:10 (trypsin: protein)-forholdet i det samme volumen (som poolet mærket prøve) af 25 mM ammoniumbicarbonat. For eksempel skal 600 ug protein prøve med et volumen på 500 ul 60 ug trypsin opløst i 500 pi 25 mM ammoniumbicarbonat. </li><li> Tilsæt trypsin løsning på de gel stykker og sat på is til rehydrere. Hvis stykkerne er ikke omfattet tilsættes 50 mM ammoniumbicarbonat-buffer. Efter rehydrering, inkuberes ved 37 ° C i 12-16 timer. </li><li> Fjerne væsken proteinekstrakt fra de inkuberede prøver. </li><li> Standse reaktionen og fjernelse af eventuelt resterende protein-fordøjelse ved at dække gelstykker med 5% myresyre, 50% acetonitril .. Omrystes gelstykker i 20 minutter ved stuetemperatur temperature. Supernatanten overføres til det ekstraherede protein prøveglas fra 5,7. Ekstraktionen gentages proceduren to gange. Tørre de ekstraherede peptider under anvendelse af SpeedVac. </li></ol> 6. Prøven Berigelse af cysTMT mærkede-peptider <ol><li> Tilføje en gradient af anti-TMT harpiks til 0,5 ml rør til en 50% opslæmning. (Gradient blev bestemt ud fra bånd koncentration fraktionering gel. Hvis en brøkdel samling består af et mørkt bånd, der er mere harpiks nødvendig. Fraktioner med svagere bånd kræver mindre harpiks, da der er mindre protein.) </li><li> Harpiksen vaskes derefter tre gange med et søjlevolumen af ​​1 x Tris-pufret saltvand (TBS) (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,2) (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products). </li><li> Tilsæt 200 ul 1xTBS til hver prøve. Prøver sættes derefter til anti-TMT-harpiks (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products) og omrøres ved stuetemperatur i 2 timer efterfulgt af vipning natten over ved 4 ° C. </li><li> Tilsættes prøve til kolonne (TheRMO Videnskabelige Pierce Protein Research Products). </li><li> Vask hver søjle tre gange med 1x 200 uL TBS. Dette efterfølges af vaskning tre gange med 0,05% CHAPS (opløst i 1x TBS). </li><li> Søjlen vaskes derefter tre gange med 4 M urinstof i 1x TBS. To hundrede mikroliter af H2O anvendes derefter til at vaske søjlen tre gange. </li><li> Hver prøve elueres tre gange med 200 pi 50% elueringspuffer (50% acetonitril, 0,4% TFA). </li><li> Prøverne tørres derefter i vakuum koncentrator. </li></ol> 7. Massespektrometrianalyse <ol><li> Resuspender prøverne i 12 pi 3% acetonitril med 0,1% myresyre og injicere 5 uL direkte på en Eksigent NanoLC 1D højtryksvæskekromatografi søjle (AB SCIEX, USA). </li><li> Peptider vil blive adskilt på en Proteopep II C18-søjle 75 um ID x 20 cm (mål, USA) under anvendelse af en 4-60% gradient (A: 3% acetonitril, 0,1% myresyre; B: 97% acetonitril, 0,1% myresyre syre)ved 3 uL / ​​minut i løbet af 60 min. </li><li> En Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL massespektrometer blev anvendt til at detektere peptider under anvendelse af en top 2 x 3 eksperiment bestående af en enkelt fase MS efterfulgt af erhvervelsen af ​​3 MS / MS spektre med højere energi C-fælde dissociation (HCD) fragmentering efterfulgt af 3 MS / MS med kollision induceret dissociation (CID) til protein identifikation. Parametre i denne tilstand var: Isolation bredde 3,0 m / z; kollisionsenergi: 50% (10% i to trin). Kun dobbelt-og tredobbelt-ladede peptider blev valgt til fragmentering. Dynamiske udelukkelse parametre blev sat til: Gentag tælle = 1; Gentag Varighed = 60; Udelukkelse liste size = 500; varigheden af ​​udelukkelsen = 28. Målværdier er som følger: MS = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. Ion overførsel gange blev sat til 500 for FTMS og 300 for MS / MS (HCD). To microscans var påkrævet for HCD spektre. </li></ol> 8. Databasesøgning og kvantificering <ol><li> De tilkøbte CID og HCD data var ennalyzed bruger Thermo Scientific Proteome Discoverer software 1,2 (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products) gennem et forgrenet workflow, som indførte en Reporter Ion kvantisator (20 ppm masse tolerance fragment-ioner) at kvantificere forholdet. Et separat segment behandles MS 2 spektre gennem Spectrum Selector, Spectrum Normalizer, og Spectrum Grouper noder. </li><li> Data blev derefter søgt mod SEQUEST søgemaskine. En 20 ppm vægt tolerance blev anvendt. Statiske modifikationer blev indstillet til cysTMT reagens (304,18 Da) og dynamiske ændringer inkluderet phosphorylering og methionin oxidation (15,99 Da). En brugerdefineret database til Solanum lycopersicum blev komponeret ved hjælp af RNA-data (med omkring 350.000 poster fra Harvard University) 13 blev anvendt i begge tilfælde. </li></ol> 9. Repræsentative resultater En repræsentant billede af en kontrol tomatplante blad og en Pseudomonas inokuleret blad ervist i figur 1. En forskel mellem behandlet kontrol og Pseudomonas behandlede blade observeres. Efter at bladene er fjernet og farvet med DAB, de-farvning fremgangsmåde muliggør histokemisk plet at vise tegn på ROS i bladvæv (figur 2). Figur 2A er repræsentativ for en kontrol blad uden farvning. Figur 2B repræsenterer af et blad behandlet med Pseudomonas og positiv farvning for H2O 2-produktion. Et eksempel på Proteome Discover dataudgang af et differentielt redox reguleret protein er vist i figur 3. Dette protein er en kendt redox reguleret protein ferredoxin-en 14 og har vist sig at spille en rolle i forsvaret mod Pseudomonas syringae pv tomat 15. Topintensiteten mellem kontrol og inokulerede prøver anvendes til at opnå relative kvantificering, der viste væsentlige ændringer i ferredoxin-1 redox regulering (p &lt;0,05). Høj intensitet toppe antyder, at dette protein oxideres som reaktion på patogener behandlingen. Figur 4 er et eksempel på Proteome Discover dataudgang af et protein, der har lignende redox regulering af et protein mellem kontrol-og inokuleret prøve. Toppe lignende intensitet antyder tilstedeværelsen af ​​disulfidbindinger ikke er reguleret af en ændring i behandling. Metoden vil revolutionere den måde, forskerne opdage redox lydhøre cysteiner og disulfider 10. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> Figur 1. Et repræsentativt billede af podet tomatblade med kontrol-opløsning (A) og Pseudomonas (B). &lt;span class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> Figur 2. Et repræsentativt billede af DAB farvning af podet tomatblade med kontrol-opløsning (A) og Pseudomonas (B). Bladene blev farvet under anvendelse 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin. Klorofyl blev fjernet fra blade ved kogning i 95% ethanol. Mørk farvning indikerer tilstedeværelsen af H2 O 2. Kun efterlader podet med bakterier kultur viste mørk farvning. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> Figur 3. Et eksempel på Proteome Discover dataudgangen af ferredoxin-1, differentielt redox reguleret protein 14. Topintensiteten over hver top anvendes til absolut kvantificering. Topintensiteten mellem kontrol og inokulerede prøver anvendesat udføre relativ kvantificering. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> Figur 4. Et eksempel på Proteome Discover dataudgang af et protein, der har lignende topintensiteten mellem kontrol-og inokuleret prøve. Toppe lignende intensitet antyder tilstedeværelsen af ​​disulfidbindinger ikke er reguleret af en ændring i behandling.

<ol>
	<li>Almeida, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).</li><li>Preiter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+virulence+gene+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+strain+DC3000.">Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000.</a> J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).</li><li>Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+of+an+oxidative+burst+during+elicitation+of+cultured+plant+cells:+role+in+defense+and+signal+transduction.">Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction.</a> Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).</li><li>Orozco-Cardenas, M., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+is+generated+systemically+in+plant+leaves+by+wounding+and+systemin+via+the+octadecanoid+pathway.">Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6553-6557 (1999).</li><li>Tonks, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+redux:+revisiting+PTPs+and+the+control+of+cell+signaling.">Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling.</a> Cell. 121, 667-670 (2005).</li><li>Alvarez, S., Wilson, G. H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+disulfide-bonded+proteins+in+Arabidopsis.">Determination of in vivo disulfide-bonded proteins in Arabidopsis.</a> J. Chromatogr. B. 877, 101-104 (2009).</li><li>Apel, K., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species:+metabolism,+oxidative+stress,+and+signal+transduction.">Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 55, 373-399 (2004).</li><li>Dayon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+proteins+in+human+cerebrospinal+fluids+by+MS/MS+using+6-+plex+isobaric+tags.">Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6- plex isobaric tags.</a> Anal. Chem. 80, 2921-2931 (2008).</li><li>Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cysteine-reactive+tandem+mass+tag+reagent+for+subproteome+labeling,+enrichment+and+quantitation.">A novel cysteine-reactive tandem mass tag reagent for subproteome labeling, enrichment and quantitation.</a> , TP169 (2010).</li><li>Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+Arabidopsis+mutants:+diaminobenzidine+stain+for+hydrogen+peroxide.">Phenotypic analysis of Arabidopsis mutants: diaminobenzidine stain for hydrogen peroxide.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).</li><li>Sethuraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-Coded+affinity+tag+(ICAT)+approach+to+redox+proteomics:+identification+and+quantification+of+oxidant-sensitive+cysteine+thiols+in+complex+protein+mixtures.">Isotope-Coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: identification and quantification of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures.</a> J. Proteome Res. 3, 1228-1233 (2004).</li><li>Asso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+and+redox+characterization+of+ferredoxins+I+and+II+from+Desulfovibrio+vulgaris+Miyazaki.">EPR and redox characterization of ferredoxins I and II from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 198-204 (1995).</li><li>Huang, H. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+resistance+to+bacterial+pathogens+affected+by+the+amount+of+ferredoxin-I+proteins+in+plants.">Disease resistance to bacterial pathogens affected by the amount of ferredoxin-I proteins in plants.</a> Mol. Plant Pathol. 8, 129-137 (2007).</li><li>Hurkman, W., Tanaka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+plant+membrane+proteins+for+analysis+by+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis.</a> Plant Physiol. 81, 802-806 (1986).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Denne protokol indeholder oplysninger om udførelse af DAB farvning samt cysTMT mærket redox cystein kvantificering. Disse procedurer er gavnlige i at undersøge produktionen af ROS samt effekt på protein regulering, når Solanum lycopersicum inokuleres med Pseudomonas syringae. De metoder, der præsenteres i denne protokol tilvejebringe en måde at undersøge ROS i hele bladprøver på en måde, der forårsager den mindste mængde af beskadigelse bladvæv. Mærkningen fremgangsmåde tilvejebringer en måde til at undersøge potentielle redox reguleret proteiner ved anvendelse af en cystein mærkningsmetode. Dette er nyttigt, når behandlingen af ​​en tidlig fase af stress respons. Fremgangsmåder, såsom isotop-kodet affinitetsmærke (ICAT) og cysTMT kan anvendes i behandlingen af ​​potentielle redox regulerede proteiner i biologiske prøver. ICAT tillader mærkning og sammenligning af to prøver 12. Begge metoder mærke frie cysteiner og kan anvendes til protein quantification 10,12. Imidlertid cysTMT fremgangsmåde muliggør en reduktion i eksperimentelle variation samt multipleksering 10. Antallet af tags til rådighed giver forskerne til også at omfatte replikater eller flere prøver i deres eksperimenterende design. Under flere prøver giver mulighed for et højere antal identificerede proteiner. En væsentlig ulempe ved cysTMT teknik er, at det bringer den samlede kvalitet af protein identifikation på grund af de selektive berigelse trin til cysTMT mærkede-peptider (6,5-6,6). Antallet af peptider til proteiner identifikation afhænger i høj grad antallet af cysteinrester i proteinsekvensen. Dette problem kan overvindes ved indgivelse del af tryptiske prøven før tilsætning til massespektrometri protein identifikation. På grund af arten af ​​det eksperimentelle design samt mærkning mekanisme at cysTMT fremgangsmåde anvender visse trin er afgørende. Under udførelsen af ​​protein præcisionpitation og pellet vaskevæsker (3,9) er det vigtigt at holde prøverne afkølet på is til reduktion af proteinnedbrydning. Under cysTMT mærkning, er fjernelse af den reducerende reagens (4,6) vigtigt, fordi prøver kan undergå omvendt mærkning. Revers mærkning er mulig, hvis reducerende reagens forbliver i prøven. Hvis prøver reduceret efter mærkning, kan cysTMT mærket fjernes. Når etiketterne tilsættes til prøverne, må pH kontrolleres (4,7) for at have optimal mærkning effektivitet. Desuden er dataanalyse afhængig af, hvad der kræves af forskeren og det ultimative mål i at bruge protokollen. Det er også afhængig af den software, der anvendes som hver software har forskellige algoritmer. Dette eksperiment anvender patogen som en elicitor til forøget produktion af reaktive oxidative arter i tomat, dog kan andre redox regulerede reaktioner måles i overensstemmelse hermed. Det eksperimentelle design kan tilpasses til andre plante-og dyrearter systemer. </p&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> MetroMix 500 </td><td> BWI Virksomheder </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-diaminobenzidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep Sekventiel Extraction Kit reagens 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X-protein-assay </td><td> Geno Teknologi </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT reagenser </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmli-prøvebuffer </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Bio-Safe Comassie (G-250-farve) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3KD kolonne </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> Immobiliseret Anti-TMT harpiks </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> Centrifuge kolonne </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II C18-søjle </td><td> Nye mål </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Proteome Discoverer 1,2 software </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge centrifugerør </td><td> Thermo Scientific Nalgene Company </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Mikrocentrifugerør (2 ml) </td><td> USA Videnskabelig </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Toppen af ​​Form &gt; Bio-Safe Coomassie StainBottom af Form </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT berigelse kit </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

Pseudomonas syringae pv. Tomat stamme DC3000 ikke kun forårsager bakteriel plet sygdom Solanum lycopersicum, men også på Brassica-arter, samt Arabidopsis thaliana, en genetisk medgørlige værtsplante 1,2. Akkumulering af reaktive oxygenarter (ROS) i kimbladene blev inokuleret med DC3000 indikerer en rolle for ROS ved modulering nekrotisk celledød under bakteriel plet sygdom tomat 3. Hydrogenperoxid, en bestanddel af ROS, fremstilles efter inokulering af tomatplanter med Pseudomonas 3. Hydrogenperoxid kan detekteres ved anvendelse af en histokemisk plet 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin (DAB) 4. DAB farvning reagerer med hydrogenperoxid til frembringelse af en brun plet på bladvæv 4. ROS har en regulatorisk rolle af den cellulære redox miljø, hvilket kan ændre redox status for visse proteiner 5. Cystein er en vigtig aminosyre følsom overredox ændringer. Under mild oxidation tjener reversibel oxidation af cystein sulfhydrylgrupper som redox sensorer og signaltransducere der regulerer en række fysiologiske processer 6,7. Tandem masse tag (TMT) reagenser muliggøre samtidig identifikation og multiplekses kvantificering af proteiner i forskellige prøver med tandem-massespektrometri 8,9. De cystein-reaktive TMT (cysTMT) reagenser muliggøre selektiv mærkning og relative kvantificering af cystein-holdige peptider fra op til seks biologiske prøver. Hver isobarisk cysTMT tag har den samme nominelle modermassen og er sammensat af en sulfhydryl-reaktiv gruppe, en MS-neutral spacerarm, og en MS / MS reporter 10. Efter mærkning blev prøverne underkastet proteasespaltning. De cystein-mærkede peptider blev beriget ved hjælp af en harpiks indeholdende anti-TMT-antistof. Under MS / MS-analyse, opstår en række reporter ioner (dvs. 126-131 Da) i lav masse regionen, give oplysninger om relativ kvantificering.Arbejdsgangen er effektiv til at reducere prøve kompleksitet, bedre dynamikområde og studere cystein modifikationer. Her præsenterer vi redox proteom analyse af Pst DC3000 behandlede tomat (Rio Grande) forlader hjælp cysTMT teknologi. Dette high-throughput-metoden har potentialet til at blive anvendt til at studere andre redox-regulerede fysiologiske processer.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Reaktive oxygenformer niveau hæves, når celler støder stressbetingelser. Her viser vi eksempel 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin farvning såvel som cysTMT mærkning og massespektrometri for at profilere redox proteom med<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Behandlet tomatblade.

Profilering Thiol Redox Proteome Brug Isotope Tagging massespektrometri

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Valgt Reaktion Overvågning massespektrometri for Absolute Protein Kvantificering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Identifikation af MyoD Interactome Brug Tandem Affinity Rensning Koblet til massespektrometri

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellular Redox Profiling ved hjælp af højindholdsmikroskopi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...