Name: profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר גרג מרטין (אוניברסיטת קורנל) וקבוצתו למתן את המתח DC3000, זרעי עגבניות, וייעוץ. הם רוצים גם להודות לד&quot;ר Zhonglin מו לעזרה עם פרוטוקול DAB ואגף Proteomics במרכז הבינתחומי UF למחקר ביוטכנולוגיה לסיוע בפיתוח השיטה. פרוטוקול להפקת חלבונים שונה מ Hurkman ו טנקה 16. פרוטוקול על cysTMT תיוג, על שלבים 4 עד 6 הותאם על בסיס המוצר המקורי תרמו פישר סיינטיפיק פירס ידנית 17. עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (MCB 0818051 ל S חן).

<ol>
	<li>Almeida, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).</li><li>Preiter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+virulence+gene+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+strain+DC3000.">Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000.</a> J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).</li><li>Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+of+an+oxidative+burst+during+elicitation+of+cultured+plant+cells:+role+in+defense+and+signal+transduction.">Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction.</a> Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).</li><li>Orozco-Cardenas, M., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+is+generated+systemically+in+plant+leaves+by+wounding+and+systemin+via+the+octadecanoid+pathway.">Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6553-6557 (1999).</li><li>Tonks, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+redux:+revisiting+PTPs+and+the+control+of+cell+signaling.">Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling.</a> Cell. 121, 667-670 (2005).</li><li>Alvarez, S., Wilson, G. H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+disulfide-bonded+proteins+in+Arabidopsis.">Determination of in vivo disulfide-bonded proteins in Arabidopsis.</a> J. Chromatogr. B. 877, 101-104 (2009).</li><li>Apel, K., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species:+metabolism,+oxidative+stress,+and+signal+transduction.">Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 55, 373-399 (2004).</li><li>Dayon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+proteins+in+human+cerebrospinal+fluids+by+MS/MS+using+6-+plex+isobaric+tags.">Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6- plex isobaric tags.</a> Anal. Chem. 80, 2921-2931 (2008).</li><li>Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cysteine-reactive+tandem+mass+tag+reagent+for+subproteome+labeling,+enrichment+and+quantitation.">A novel cysteine-reactive tandem mass tag reagent for subproteome labeling, enrichment and quantitation.</a> , TP169 (2010).</li><li>Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+Arabidopsis+mutants:+diaminobenzidine+stain+for+hydrogen+peroxide.">Phenotypic analysis of Arabidopsis mutants: diaminobenzidine stain for hydrogen peroxide.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).</li><li>Sethuraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-Coded+affinity+tag+(ICAT)+approach+to+redox+proteomics:+identification+and+quantification+of+oxidant-sensitive+cysteine+thiols+in+complex+protein+mixtures.">Isotope-Coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: identification and quantification of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures.</a> J. Proteome Res. 3, 1228-1233 (2004).</li><li>Asso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+and+redox+characterization+of+ferredoxins+I+and+II+from+Desulfovibrio+vulgaris+Miyazaki.">EPR and redox characterization of ferredoxins I and II from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 198-204 (1995).</li><li>Huang, H. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+resistance+to+bacterial+pathogens+affected+by+the+amount+of+ferredoxin-I+proteins+in+plants.">Disease resistance to bacterial pathogens affected by the amount of ferredoxin-I proteins in plants.</a> Mol. Plant Pathol. 8, 129-137 (2007).</li><li>Hurkman, W., Tanaka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+plant+membrane+proteins+for+analysis+by+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis.</a> Plant Physiol. 81, 802-806 (1986).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

פרוטוקול זה מספק מידע על ביצוע מכתים DAB כמו גם cysTMT שכותרתו כימות ציסטאין חיזור. נהלים אלה מועילים לבחון ייצור של ROS, כמו גם השפעה על ויסות חלבון כאשר Solanum lycopersicum הוא מחוסן עם Pseudomonas syringae. השיטות שהוצגו בפרוטוקול זה מספק דרך לבחון ROS בדגימות עלים שלמים בצורה שגורמת את הכמות המינימלית של פגיעה רקמת העלה. הליך תיוג מספק דרך לבחון חלבונים מוסדר חמזור פוטנציאלי על ידי ניצול שיטת תיוג ציסטאין. זה מועיל כאשר בוחנים בשלב מוקדם של תגובת הלחץ. שיטות כגון תג איזוטופ מקודדת זיקה (ICAT) ו cysTMT ניתן להשתמש בבדיקת פוטנציאליים חלבונים מוסדרים חמזור של דגימות ביולוגיות. ICAT מאפשר תיוג והשוואה של שני מדגמים 12. שתי השיטות לתייג cysteines בחינם והוא יכול לשמש חלבון quantification 10,12. עם זאת, השיטה cysTMT מאפשר ירידה וריאציה ניסיוני וכן ריבוב 10. מספר התגים זמינים מאפשר לחוקרים כוללים משכפל או דוגמאות רבות בתכנון הניסוי שלהם. שיש דוגמאות יותר מספק פוטנציאל למספר גבוה יותר של חלבונים המזוהים. החיסרון העיקרי של השיטה cysTMT היא שזה פוגע באיכות הכוללת של זיהוי החלבון בגלל הצעדים העשרה סלקטיבית cysTMT שכותרתו למוצרי פפטידים (6.5-6.6). מספר פפטידים לזיהוי החלבון תלוי בעיקר במספר שאריות ציסטאין ברצף החלבון. בעיה זו ניתן להתגבר על ידי הגשת חלק מדגם tryptic לפני העשרה לזיהוי ספקטרומטריית מסה חלבון. בשל אופיו של עיצוב ניסיוני, כמו גם מנגנון תיוג כי שיטת cysTMT מנצל, צעדים מסוימים הן קריטיות. בעת ביצוע חלבון precipitation ו גלולה כביסות (3.9) חשוב לשמור על דגימות קרה כיסתה את הקרח כדי לצמצם פירוק חלבונים. במהלך תיוג cysTMT, הסרת מגיב צמצום (4.6) חשוב כי דגימות עשוי לעבור תיוג הפוך. תיוג הפוך אפשרי אם הפחתת מגיב נשאר המדגם. אם דגימות מופחתים לאחר תיוג, תג cysTMT ניתן להסיר. פעם התוויות נוספות דגימות, רמת ה-pH יש לבדוק (4.7) כדי שיהיה תיוג יעילות אופטימלית. בנוסף, ניתוח נתונים תלוי מה נדרש החוקר ואת המטרה הסופית באמצעות פרוטוקול. זה תלוי גם תוכנות בשימוש כתוכנה לכל אחד מהם יש אלגוריתמים שונים. ניסוי זה מנצל הפתוגן כמו elicitor לייצור משופר של מינים חמצון תגובתי ב עגבניות, עם זאת, אחרים תגובות מוסדרים חמזור ניתן למדוד בהתאם. זה עיצוב ניסיוני ניתנת להתאמה צמח המערכות האחרות של בעלי חיים. </p&gt;

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> MetroMix 500 </td><td> BWI חברות </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &quot;, Diaminobenzidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep הפקת רצופות ערכת מגיב 3 </td><td> ביו רד </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X חלבון assay </td><td> Geno טכנולוגיה </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT ריאגנטים </td><td> Thermo Scientific מחקר פירס אבקות חלבון </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmli מאגר לדוגמה </td><td> ביו רד </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Bio-Safe Comassie (G-250 הכתם) </td><td> ביו רד </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon טור 3KD </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> משותקת נגד TMT שרף </td><td> Thermo Scientific מחקר פירס אבקות חלבון </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> צנטריפוגה עמודה </td><td> Thermo Scientific מחקר פירס אבקות חלבון </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II C18 עמודה </td><td> חדש המטרה </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> א.ב. Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Discoverer Proteome 1.2 התוכנה </td><td> Thermo Scientific מחקר פירס אבקות חלבון </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge Tube צנטריפוגה </td><td> Thermo Scientific Nalgeנה החברה </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Microcentrifuge צינור (2ml) </td><td> ארה&quot;ב מדעי </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% מיני הפושט צורה ולובש צורה TGX Precast ג&#39;ל </td><td> ביו רד </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> גבי טופס &gt; Bio-Safe Coomassie StainBottom של טופס </td><td> ביו רד </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT ערכת ההעשרה </td><td> Thermo Scientific מחקר פירס אבקות חלבון </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

Pseudomonas syringae PV. עגבניות DC3000 זן לא רק גורם למחלות גרגר החיידקים Solanum lycopersicum אלא גם על מינים Brassica, כמו גם על thaliana ארבידופסיס, צמח צייתן גנטית 1,2 המארח. הצטברות של מינים החמצן מגיב (ROS) ב cotyledons מחוסן עם DC3000 מצביע על תפקידו של ROS במוות ויסות תא נמקי בעת מחלה חיידקית גרגר של עגבניות 3. מי חמצן, מרכיב של ROS, מופק לאחר חיסון של שיחי עגבניות עם Pseudomonas 3. מי חמצן ניתן לאתר באמצעות histochemical כתם diaminobenzidine 3&#39;-3 &quot;(DAB) 4. מכתים DAB מגיב עם מי חמצן כדי לייצר חום כתם 4 רקמת העלה. ROS יש תפקיד הרגולציה של הסביבה חמזור הסלולר, אשר יכול לשנות את הסטטוס חיזור של חלבונים מסוימים 5. ציסטאין היא חומצה אמינית חשובה רגישחמזור שינויים. תחת חמצון קל, חמצון הפיך של קבוצות ציסטאין sulfhydryl משמש חיישנים חמזור ו מתמרים האות המווסתים מגוון תהליכים פיזיולוגיים 6,7. טנדם המוניים תג (TMT) ריאגנטים לאפשר זיהוי משתף מרובב quantitation של חלבונים בדגימות שונות באמצעות טנדם ספקטרומטריית מסה 8,9. את תגובתי ציסטאין-TMT (cysTMT) ריאגנטים לאפשר תיוג סלקטיבי quantitation היחסי של ציסטאין המכיל פפטידים ממרחק של עד שש דגימות ביולוגיות. כל תג cysTMT isobaric יש אותה מסה הורה הנומינלי מורכב קבוצה sulfhydryl-reactive, הזרוע MS-נייטרלי spacer ואת הכתב MS / MS 10. לאחר תיוג, הדגימות היו נתונים העיכול פרוטאז. פפטידים ציסטאין, שכותרתו היו מועשר באמצעות שרף המכיל נוגדנים נגד TMT. במהלך ניתוח MS / MS, סדרה של יוני הכתב (כלומר, 126-131 דה) מופיעים באזור מסה נמוכה, מתן מידע על quantitation יחסית.זרימת עבודה יעילה להפחתת המורכבות המדגם, שיפור טווח דינמי ולומדים שינויים ציסטאין. כאן אנו מציגים ניתוח proteomic חיזור של עגבניות ה-pst DC3000 מטופלים (Rio Grande) עוזבת באמצעות טכנולוגיית cysTMT. שיטה זו תפוקה גבוהה יש פוטנציאל להיות מיושם על לימוד אחרים חמזור מוסדר תהליכים פיזיולוגיים.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

רמת תגובתי מינים החמצן הוא גבוה כאשר תאים נתקלים בתנאי עקה. כאן אנו מציגים דוגמה מכתים diaminobenzidine &#39;3&#39;-3, כמו גם תיוג cysTMT ו ספקטרומטריית מסה לפרופיל proteome חיזור ב<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; טיפול עלים עגבניות.

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...