Name: profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00
Duration: 12 min 7 s
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著者らは、DC3000株、トマトの種子、およびアドバイスを提供するために博士はグレッグ·マーティン（コーネル大学）と彼のグループに感謝します。彼らはまた、博士ZhonglinはDABプロトコルとメソッド開発の支援のためのバイオテクノロジー研究のためのUF学際センターでプロテオミクス部門のヘル​​プは覚書に感謝したいと思います。タンパク質抽出のためのプロトコルはHurkman田中16から変更されました。 cysTMTのラベル上のプロトコルは、手順4から6は、マニュアル17オリジナルのサーモフィッシャーサイエンティフィックピアスの製品に基づいて適応されました。この作品は、国立科学財団（SチェンにMCB 0818051）によって資金を供給された。

1。成長実生と準備細菌<ol><li>苗は成長チャンバー（22℃8時間の光の光周期160マイクロモル光子m -2 s -1でのMetroMix 500土壌の混合物（BWI会社）で発芽さ20ダーク°C、16時間℃で1週間。相対湿度が70％に設定されていました。ドライになってから土を保つために、必要に応じて苗木を水道水で水をまかれた。 </li><li>類似した大きさの二つの苗は、その後MetroMix 500土壌を含む4 &quot;径ポットに移植し、1.1と同じ条件で追加の3週間栽培されています。 </li><li> Pseudomonas syringaeの（PST）は、キングスB培地（KBM）プレート（1リットル当たり：20グラムプロテオースペプトン、0.1975グラムのMgSO 4、1％グリセロール、1.5グラム、K 2 HPO 4、18グラム寒天培地）に最初にT-縞であるために栽培28で2日間℃、シングルコロニーを300μL液体キングスB培地（20グラムプロテオースペプトン、0.1975グラムのMgSO 4に混合し、収集され</sub&gt;を、10 mLのグリセロール、100倍、K 2 HPO 4株式の10 mLの（H 2 O 10mLのK 2 HPO 4 1.5 g）、およびキングスBミディアムプレート上に広げる。これは、28℃で一晩培養し、 </li><li>細菌接種物を20mLのH 2 OにKBMプレートから培養した細菌をこすることによって調製される0.03（〜10 6 CFU / ml）のOD 600を接種緩衝液1 L（10mMのMgCl 2 + 400μLSilwett-70）で調製されています。接種バッファマイナス細菌は、コントロール·ソリューションのために準備された。 </li></ol> 2。 PSTファイルとH 2 O 2とトマトの接種組織化学的染色<ol><li>四週齢の植物が30秒、上記の接種液に浸漬することにより接種した。透明なビニール袋は、すぐに接種した後に植物の上に置かれた。 </li><li> 3&#39;-3 &#39;ジアミノベンジジン（DAB）は11（H 2 Oで1 mg / mlのDABは、pH 3.8（塩酸））3つのDを作製した染色AYSは、前の完全な可溶化を達成するために使用します。溶液を室温で混合するために揺り動かした。 </li><li>二十四時間処理した後、完全に展開された葉は表皮面を上にして染色するDABに配置され、除去し、真空で15分間浸透させた。葉はその後、染色のために一晩、室温で暗所に入れられました。 </li><li>葉は10分間95％エタノール中で煮沸し、次に75％エタノールに格納されていました。 </li></ol> 3。タンパク質抽出<ol><li>収穫した後、トマトの葉を乳鉢と乳棒を用いて液体窒素で微粉末に粉砕した。 </li><li>組織0.5 gの場合、フェノール1.25 mLのトリスpH 8.8緩衝追加し、抽出緩衝液の1.25 / mLの0.5グラム（0.1 MのTris-HCl pHは8.8、10mMのEDTA、0.9 Mショ糖）は、その後にさらにいくつかの分間研削続けるヒュームフード。 </li><li>オークリッジ遠心チューブ（サーモフィッシャーサイエンティフィックナルゲン社）に抽出液を移し、室温で2時間振とうする。 </li><li> 5000×gで遠心分離と15℃で10分間。新しいきれいなチューブにトップフェノール相を転送します。 </li><li>等量で逆抽出水相は、フェノールのバッファを抽出し、30分間シェーカーで撹拌します。新しいファルコンチューブに抽出液を遠心分離し、転送します。 </li><li>上記のステップ1つのより多くの時間を繰り返して、新しいオークリッジチューブに抽出液を転送します。 </li><li> 100％メタノール（-20℃で保存）の0.1 M酢酸アンモニウム5ボリュームを追加することにより、フェノール抽出したタンパク質を沈殿させる。一晩-20℃でボルテックスし、インキュベートします。 </li><li> 20分、20,000×gで4℃で遠心分離によってタンパク質ペレットを収集します。 </li><li> 80パーセント冷アセトンとメタノールと2回の冷0.1M酢酸アンモニウムでペレットを2回洗浄します。ペレットに1.5 mLの冷70％エタノールを加えると一時停止します。 20分を2 mlのマイクロ遠心チューブ（米国サイエンティフィック）、14,000 rpmで遠心分離し、4°Cに転送されます。エタノールを除去します。 </li><li> Speed​​Vacコンセントレータでペレットを軽く乾燥させ、タンパク質のEXTRに溶解アクションバッファ例えば、ReadyPrepタンパク質抽出キット試薬​​3（8 M尿素、4％CHAPS、40mMのトリス塩基、2 Mチオ尿素）（Bio-Rad社）。ペレットを形成するために、30分間14,000 rpmで、20°Cで遠心します。上清を収集します。 </li><li>製造元のマニュアル（ジェノ技術）によるCB-Xタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定します。 </li></ol> 4。 cysTMTsとサンプル調製およびペプチドのラベリング<ol><li> 2から5μg/μLの濃度でタンパク質試料を準備します。ここでは、それぞれの質量タグの20μlを、50μLのサンプルをタンパク質100μgを使用しています。この実験では全6タグが使用されました。 </li><li>遊離のチオール基をブロックするタンパク質試料にアルキル化、等量のバッファー（100mMのトリス-HCl pH7.5、200mMのヨードアセトアミド）を追加します。バッファは、新鮮な準備する必要があります。アルキル化は、37℃で1時間で実行されます。 </li><li>一晩-20℃で冷80％アセトン1 mLを加えることによってタンパク質を沈殿させる。 14,000遠心分離によってペレットのタンパク質回転、4℃で20分間。たびにボルテックスを80％アセトンでペレットを3回洗浄します。上清を除去し、氷の上で乾燥した中を放送することができます。 </li><li> 50μLの溶解バッファー（6M尿素、50mMのトリス塩基、1mM EDTA）にペレットを再懸濁します。 100mMのトリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の0.5μL、その後室温で1時間インキュベートすることによりジスルフィド結合を還元するために追加されます。 </li><li>タグを可溶化する試薬チューブにアセトニトリル20μLを加えることによってタグを準備します。渦と底にスピンダウンする。 </li><li>マイクロコン3KD遠心フィルター装置（Millipore）を用いて余分なTCEPをよく洗ってください。マイクロコン3KD列に50μLのサンプルを追加し、列に50μLの溶解バッファー。 10,000×gで、4℃で15分間遠心合計3回のためにこの手順を繰り返します。列を除去してクリーンなチューブに反転させる。 1,000×gで、4℃で5分間遠心</li><li> pHをチェックしてください。必要に応じて、1 M HClで7.0から8.0にpHを調整します。 </li><li> cysTMの5μLを追加します。各サンプルにT試薬（cysTMT試薬キットは、最大500μgのタンパク質を20μLタグを提供しています。このメソッドは、100μgのタンパク質を使用して、したがって、我々は、タグの五分の一使用）。反応は室温で2時間撹拌を続行することができます。 </li><li>サンプルは、1:1の比率でLaemmliサンプル緩衝液（Bio-Rad社）と組み合わせました。 </li></ol> 5。非反応タグサンプルの分画の除去<ol><li>サンプルは、5分間煮沸し、プレキャスト12％ポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad社）上で分離した。ゲルを濾過し、H 2 Oで5分間隔で3回リンスし、1時間クーマシーブルー（Bio-Rad社）で染色した。ゲルは、H 2 Oで一晩脱染色した</li><li>十二画分を各ゲルのレーンから採取した。画分は、タンパク質のバンドの濃度によって決定された。画分は、1mmの切り刻まと1.5 mlチューブに回収した。 </li><li>ゲル片を脱染色したH 2が50％アセトニトリル、0.1 M重炭酸アンモニウムを使用していた</サブ&gt; O.青色がゲル片（3〜4回、各15分の時間）から削除されるまで、この手順を繰り返す必要があります。 </li><li>脱染色したゲル片を15分間100％アセトニトリル（ゲル片をカバー）を使用して乾燥させ、上清を除去し、作品はSpeed​​Vacを使用して乾燥させた。 </li><li> 25mMの重炭酸アンモニウム、同体積の比（としてプールされたラベルのサンプル）：1:10（タンパク質トリプシン）でトリプシン（Promega）を溶解する。たとえば、500μLの容積600μgのタンパク質サンプルを25 mM重炭酸アンモニウムの500μLに溶解した60μgのトリプシンを必要とします。 </li><li>ゲル片をトリプシン溶液を追加し、再水和するため氷の上で設定します。の部分がカバーされていない場合は、50 mM重炭酸アンモニウムバッファを追加します。水分補給した後、12〜16時間37℃でインキュベートする。 </li><li>培養サンプルから液体のタンパク質抽出物を削除します。 </li><li>反応を停止し、5％ギ酸、50％アセトニトリルでゲル片を被覆することにより、残りのタンパク質消化物を除去...部屋TEで20分間ゲル片を振るmperature。 5.7から抽出したタンパク質サンプルチューブに上清を移します。二回の抽出手順を繰り返します。 Speed​​Vacを使用して抽出したペプチドを乾燥させます。 </li></ol> 6。 cysTMT標識ペプチドのサンプル濃縮<ol><li> 50％スラリーで0.5 mLチューブに抗TMT樹脂のグラデーションを追加します。 （勾配が分別ゲルのバンドの濃度から決定した。フラクションコレクションは暗いバンドで構成されている場合、より多くの樹脂が必要となります。少ないタンパク質があるとしても弱いバンドを有する画分が少ない樹脂を必要とします。） </li><li>次いで、樹脂を1Xトリス緩衝生理食塩水（TBS）（25 mMトリス、0.15MのNaCl、pH 7.2）（サーモフィッシャーサイエンティフィックピアスタンパク質構造·機能研究製品）の1列のボリュームで3回洗浄されています。 </li><li>各サンプルに200μL1xTBSを追加します。次いで、試料を抗TMT樹脂（サーモフィッシャーサイエンティフィックピアスタンパク質構造·機能研究製品）に加え、4℃で一晩ロッキング続いて2時間室温で攪拌されている</li><li>カラムにサンプルを追加（RMOサイエンティフィックピアスタンパク質構造·機能研究製品）。 </li><li> 1×200μLのTBSで各列に3回洗浄します。そして、これは0.05％CHAPS（1X TBSに溶解）で3回洗浄して続いています。 </li><li>次いで、カラムを1×TBSで4 M尿素で3回洗浄されています。 H 2 Oの二百マイクロリットルをカラム3回洗浄するために使用されます。 </li><li>各サンプルを200μLの50％溶出バッファー（50％アセトニトリル、0.4％TFA）で3回溶出される。 </li><li>次いで、試料を真空コンセントレータで乾燥させる。 </li></ol> 7。質量分析<ol><li> 0.1％ギ酸を3％アセトニトリル、12μLのサンプルを再懸濁し、EksigentナノLC-1D高圧液体クロマトグラフィーカラム（AB SCIEX、米国）に直接5μLを注入します。 </li><li>ペプチドはProteopep II C18カラム内径75μmで分離される4から60パーセントの勾配を（使用して、×20センチ（新しい目的、アメリカ）：3％アセトニトリル、0.1％ギ酸、B：97％アセトニトリル、0.1％ギ酸酸）60分以上で3μL/分。 </li><li>サーモ科学LTQ Orbitrap XL質量分析計は、トップ2を使用してペプチドを検出するために使用した単段で構成された×3実験MS 3、MSに続いて高エネルギーC-トラップ解離（HCD）の断片化で3 MS / MSスペクトルの取得に続いてタンパク質同定のための衝突誘起解離（CID）と/ MS。このモードのパラメータは次のとおりだった：分離幅：3.0 m / zの、コリジョンエネルギー：50％（2つのステップを含む10％）。唯一の二重と三重に帯電したペプチドは、断片化のために選ばれた。動的な除外パラメータがに設定されていました：カウント= 1を繰り返します。繰り返し時間= 60;除外リストのサイズ= 500;除外期間= 28。目標値は次のとおりです。MS = 5 E 5; MS / MS（HCD）= 1 E 5。イオンの転送時間は、MS / MS（HCD）のFTMS、300は500に設定されています。二microscansはHCDスペクトルに必要であった。 </li></ol> 8。データベース検索と定量<ol><li>取得したCIDとHCDのデータがあった比を定量化するためにレポーターイオン量子化（フラグメントイオンの20 ppmの質量公差）を実装し分岐したワークフローを介してサーモ科学プロテオームDiscovererのソフトウェア1.​​2（サーモフィッシャーサイエンティフィックピアスタンパク質構造·機能研究製品）を使用してnalyzed。独立したセグメントは、スペクトラムセレクタ、スペクトラムノーマ、およびスペクトラムGrouperのノードを介してMS 2スペクトルを処理しました。 </li><li>その後、データはSEQUESTの検索エンジンに対して検索した。 20 ppmの質量公差が使用されています。静的な変更がcysTMT試薬に設定され（304.18 Da）と動的な変更は、リン酸化およびメチオニン酸化（15.99 Da）を含まれていました。 トマトのカスタムデータベースは、13両方のケースで使用した（ハーバード大学から約35万のエントリを持つ）RNAデータを使用して構成されていた。 </li></ol> 9。代表的な結果コントロールトマト植物の葉および Pseudomonas接種葉の代表的なイメージがある図1に示す。処理されたコントロールおよびシュードモナス処理葉の間に差が観察される。葉を除去し、脱染色プロセスは葉組織内ROSの兆し（ 図2）を表示するために組織化学的染色を可能にします。DABを用いて染色された後、 図2Aは無染色のコントロールの葉の代表である。 図2Bは、代表的であるH 2 O 2生産のためのシュードモナスおよび陽性で処理された葉の。差レドックス調節タンパク質のプロテオームディスカバー·データ出力の例を図3に示されています。このタンパク質は、既知のレドックス調節タンパク質のフェレドキシン-1 14であるとPseudomonas syringaeの PV トマト 15に対する防御に重要な役割を果たすことが示されている。コントロールと接種し、サンプル間のピーク強度はferredoxで有意に変化した相対的な定量化を、取得するために使用されin-1のレドックス制御（P &lt;0.05）。高強度のピークがこのタンパク質は、病原体の治療に反応して酸化されることを示唆している。 図4は、制御と接種したサンプル間のタンパク質の類似したレドックス制御を有するタンパク質のプロテオームディスカバー·データ出力の例です。同様の強度のピークは、治療の変更によって規制されていないのジスルフィド結合の存在を示唆している。方法は、科学者たちは酸化還元反応するシステインとジスルフィド10を検出する方法を変革します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> 図1。接種したトマトの代表的なイメージは、コントロール溶液（A）、 シュードモナス （B）の葉。 &lt;スパンクラス= &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> 図2：接種したトマトのDAB染色の代表的なイメージは、コントロール溶液（A）、 シュードモナス （B）の葉。葉は3&#39;-3 &#39;ジアミノベンジジンを用いて染色した。クロロフィルは、95％エタノール中で煮沸して葉から削除されました。暗い染色はH 2 O 2の存在を示しています。唯一の暗い染色を示した細菌の培養を接種したままになります。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> 図3フェレドキシン-1のプロテオームディスカバー·データ出力、差動レドックス調節蛋白質14の例を示します。各ピークの上記のピーク強度は絶対的な定量化のために使用されています。コントロールと接種し、サンプル間のピーク強度が使用されます相対的な定量化を実行することができます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> 図4コントロールと接種した試料との間の類似したピーク強度を有するタンパク質のプロテオームディスカバー·データの出力例を示します。同様の強度のピークは、治療の変更によって規制されていないのジスルフィド結合の存在を示唆している。

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利害の衝突が宣言されません。

このプロトコルは、DAB染色を行うことについての情報などcysTMTラベルレドックスシステインの定量化を提供します。これらの手順は、ROSの産生だけでなく、 トマトがPseudomonas syringaeのを接種された蛋白質の調節に及ぼす影響を検討する上で有益である。このプロトコルで提示方法は、葉組織への損傷の最低額を引き起こすように全体の葉のサンプルでROSを検証する方法を提供します。ラベリングの手順では、システイン標識法を利用することにより、潜在的にレドックス調節タンパク質を調べる方法を提供します。ストレス応答の初期段階を調べるときに、これは有益です。 このような同位体コード化された親和性タグ（ICAT）とcysTMTなどのメソッドは、生物学的サンプル中に潜在的な酸化還元の安定化タンパク質を調べることで使用することができます。 ICATは、標識2つのサンプル12を比較することができます。どちらの方法で遊離のシステインにラベルを付けquantificタンパク質を使用することができますation 10,12。しかし、cysTMT方法は、実験的な変動の減少と同様に10を多重化することができます。利用可能なタグの数は、研究者が実験的なデザインで複製または複数のサンプルを含めることができます。より多くのサンプルを持つことは、同定されたタンパク質の数の増加の可能性を提供します。 cysTMT技術の主な欠点は、それが原因cysTMTラベルペプチド（6.5から6.6）の選択的濃縮工程のタンパク質同定の全体的な品質を損なうことである。タンパク質同定のためのペプチドの数は、タンパク質配列中のシステイン残基の数に大きく依存します。この問題は、質量分析、タンパク質の同定のために濃縮する前に、トリプシンのサンプルの一部を提出することによって克服することができます。 実験的なデザインだけでなく、cysTMT方法が利用するラベリングメカニズムの性質上、特定の手順が重要です。タンパク質PRECIを実行している間pitationとペレット洗浄液（3.9）は、タンパク質の分解を低減するために氷上で冷却した試料を保持することが重要です。サンプルは逆ラベリングを受ける可能性があるためcysTMTラベリング時には、還元剤（4.6）の除去が重要である。試薬を減らすことでサンプルのままであれば逆にラベリングが可能です。サンプルはラベルの後に減少している場合は、cysTMTタグを削除することができます。ラベルはサンプルに追加されると、pHレベルを最適な標識効率を持つために（4.7）をチェックする必要があります。さらに、データ解析は、研究者とプロトコルを使用しての究極の目標に必要とされているものに依存しています。また、各ソフトウェアは、異なるアルゴリズムを持っているとして使用されているソフトウェアに依存しています。 この実験は、トマトの反応性酸化種の強化された生産のためのエリシターとして病原体を利用しますが、他の酸化還元反応の規制はそれに応じて測定することができる。この実験的なデザインは、他の植物や動物のシステムに適応可能です。 </P&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> MetroMix 500 </td><td> BWI会社</td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39; - ジアミノベンジジン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep逐次抽出キットの試薬3 </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-Xタンパク質アッセイ</td><td>ジェノテクノロジー</td><td> 786-12X </td></tr><tr><td> cysTMT試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックピアスタンパク質構造·機能研究製品</td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmliサンプルバッファー</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td>バイオセーフComassie（G-250染色） </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td>マイコン3KD列</td><td>ミリポア</td><td> 42403 </td></tr><tr><td>固定化したアンチTMT樹脂</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックピアスタンパク質構造·機能研究製品</td><td> 90076 </td></tr><tr><td>遠心カラム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックピアスタンパク質構造·機能研究製品</td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II C18カラム</td><td>新たな目的</td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td>ナノLC-1D HPLC </td><td> AB SCIEX </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> Speed​​Vac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td>プロテオームDiscovererの1.2ソフトウェア</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックピアスタンパク質構造·機能研究製品</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>プロメガ</td><td> V5111 </td></tr><tr><td>オークリッジ遠心管</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックNalgeNE会社</td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ（2ミリリットル） </td><td>米国サイエンティフィック</td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12パーセントミニプロティアンTGXプレキャストゲル</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td>フォームのトップ フォームの&gt;バイオセーフクマStainBottom </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT濃縮キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックピアスタンパク質構造·機能研究製品</td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

Pseudomonas syringaeの PV。 トマトひずみ DC3000は、 シロイヌナズナ 、遺伝的に扱いやすい宿主植物1,2にトマトでなく、 アブラナ属の種の細菌斑点病を引き起こすだけでなく、だけではなく。 DC3000を接種した子葉における活性酸素種（ROS）の蓄積は、トマト3の細菌性斑点病の間に調節する壊死性細胞死におけるROSの役割を示しています。過酸化水素、ROSのコンポーネントは、 シュードモナス 3トマトの接種後に生成されています。過酸化水素は、組織化学的染色3&#39;-3 &#39;ジアミノベンジジン（DAB）4を使用して検出することができます。 DAB染色は、葉組織4茶色の汚れを生成する過酸化水素と反応します。 ROSは、5特定のタンパク質の酸化還元状態を変更することができます細胞のレドックス環境の調節の役割を持っています。システインに依存する重要なアミノ酸です。酸化還元変化します。軽度の酸化の下で、システインのスルフヒドリル基の可逆的酸化は生理的プロセス6,7の様々な規制レドックスセンサーとシグナルトランスデューサーとして機能します。タンデム質量タグ（TMT）の試薬 ​​は同時識別を有効にして、タンデム質量分析法8,9を使用してさまざまな試料中のタンパク質の定量を多重化。システイン反応TMT（cysTMT）試薬は選択的標識と6の生物学的サンプルまでのペプチドをシステイン含有の相対定量を可能にします。各重体cysTMTタグは、同じ公称親の質量を持ち、スルフヒドリル反応性基は、MS-ニュートラルスペーサーアームとMS / MSレポーター10で構成されています。標識後、試料をプロテアーゼ消化を受けた。システイン標識ペプチドは、抗TMT抗体を含有する樹脂を用いて濃縮した。 MS / MS分析時に、レポーターイオンの系列（すなわち、126から131 DA）は相対定量に関する情報を提供し、低質量領域に出現する。ワークフローは、サンプルの複雑さを軽減するダイナミックレンジを向上させ、システイン修飾を研究するための効果的である。ここでは 、PST DC3000扱わトマトのレドックスプロテオーム解析を提示し（リオグランデ）cysTMT技術を使用して残します。このハイスループット法は、他の酸化還元調節の生理学的プロセスを学ぶに適用される可能性を秘めています。

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Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

細胞がストレス状況に遭遇すると活性酸素種のレベルが上昇している。ここでは、3&#39;-3 &#39;ジアミノベンジジン染色などcysTMTラベリングとの酸化還元プロテオームのプロファイリングを行うための質量分析の例を示します<em&gt; Pseudomonas syringaeの</em&gt;トマトの葉を処理した。

同位体タグ質量分析法を用いたチオールレドックスプロテオームのプロファイリング

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

profiling-thiol-redox-proteome-using-isotope-tagging-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDIサンプル調製：超薄層法

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

生物学

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L</subキャプチャの複合質量分析法（CCMS）別> -ホモシステイン結合タンパク質

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

タンデムアフィニティー精製を使用してのMyoDインタラクトームの同定は、質量分析に結合します

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...