Name: profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00
Duration: 12 min 7 s
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저자 DC3000 스트레인, 토마토 종자 및 조언을 제공하는 닥터 그렉 마틴 (코넬 대학)와 그의 그룹을 감사드립니다. 또한 박사 Zhonglin은 그 방법 개발 지원을위한 바이오 연구 University of Florida는 학제간 센터에서 DAB 프로토콜 및 Proteomics 부문과 관련하여 도움이 MOU 체결 감사드립니다. 단백질 추출을위한 프로토콜은 Hurkman와 다나카 16 일부터 바뀌었습니다. 6 cysTMT 라벨, 4 단계의 프로토콜은 원래 써모 피셔 과학 피어스 제품 설명서를 17 일 기준으로 적응되었다. 이 작품은 국립 과학 재단 (S 첸에 MCB 0,8​​18,051)에 의해 재정 지원되었다.

1. 성장하는 모종 및 준비 박테리아 <ol><li> 모종은 성장 챔버 (22 8 시간 빛의 photoperiod 160 μmol 광자 m -2 s의 -1에서의 MetroMix 500 토양 혼합물 (BWI ​​회사)에 germinated되는 20 어두운 ° C와 16시간 ° C에서 1 주일. 상대 습도는 70 %로 설정되었다. 건조되기에서 토양을 유지하기 위해 필요에 따라 모종은 수돗물로 물이나되었다. </li><li> 유사한 크기의 두 모종 그 다음 MetroMix 500 토양을 포함한 4 &quot;직경 냄비에 이식 및 1.1과 같은 조건에서 추가로 3 주동안은 성장하고 있습니다. </li><li> 모나스 syringae (PST)는 킹스 B 중간 (KBM) 접시 (리터 당 20g Proteose 펩톤, 0.1975 g MgSO 4, 1 % 글리세롤, 1.5 g K 2 HPO 4, 18g 한천)에 처음 T-streaked이며위한 성장 28 이틀은 ° C. 하나의 식민지가 300μl 액체 킹스로 혼합, 수집되는 B 매체 (20g Proteose 펩톤, 0.1975 g MgSO 4 </sub&gt;을, 10 ML의 글리세롤, 100x K 2 HPO 4 주식의 10 ML (H 2 O의 10 ML의 K 2 HPO 4 1.5 g) 및 킹스 B 중간 판에 퍼졌다. 이것은 28 ° C.에 밤새도록 배양해 있습니다 </li><li> 박테리아의 inoculum 20 ML H 2 O.로 KBM 접시에서 교양 박테리아를 부서에 의해 준비가되어 있습니다 0.03의 OD 600이 (~ 10 6 cfu / ml) 쇼핑 (10 밀리미터 MgCl 2 + 400 μL Silwett-70) 접종 버퍼 1 패에 준비가되어 있습니다. 접종 버퍼 마이너스 박테리아는 제어 솔루션을 위해 작성됐다. </li></ol> 2. PST 및 H 2 O 2 토마토의 접종 얼룩 Histochemical <ol><li> 포 주 오래된 식물은 30 초 동안 위의 접종 솔루션 파버으로 주사되었다. 투명 비닐 봉투는 즉시 접종 후 식물을 통해 거쳐야했다. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine (DAB)은 11가 (H 2 O 1 밀리그램 / ML DAB, 산도 3.8 (HCL)) 세 d 개의 준비되었다 얼룩ays 전에 완전한 solubilization을 달성하기 위해 사용합니다. 솔루션은 상온에서 혼합하라고 누볐어되었다. </li><li> 24 시간 밖에 치료 후 완전히 확장 잎은 표피 쪽을 얼룩 DAB에 배치, 제거 및 진공은 15 분 동안에 침투되었다. 잎은 그러면 염색법을위한 밤 내내 실내 온도에서 어두운 넣어되었습니다. </li><li> 잎은 10 분 95 % 에탄올에 삶은 후 75 % 에탄올에 보관되었다. </li></ol> 3. 단백질 추출 <ol><li> 수확 후에는 토마토 잎은 박격포와 유봉을 사용하여 액체 질소와 미세 분말로 외출했다. </li><li> 조직 0.5 g 들어, 페놀 1.25 ML 트리스 산도 8.8 버퍼에 추가 및 추출 버퍼의 1.25 ML / 0.5 g (0.1 M 트리스-HCL pH는 8.8, 10 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.9 M의 자당)는 다음의 몇 분 동안 분쇄 계속 퓸 후드. </li><li> Oakridge의 원심 분리기 튜브 (써모 피셔 과학 Nalgene 회사)에 추출물을 전송하고 실온에서 2 시간 동안 선동. </li><li> 5,000 XG에 원심 분리기15 ° C ~ 10 분입니다. 새로운 깨끗한 튜브로 가기 페놀 위상을 전송합니다. </li><li> 동일한 볼륨 백 추출 수성 단계는 페놀 버퍼를 추출, 30 분 대한 흔드는에 선동. 원심 분리기와 새로운 팔콘 튜브에 추출물을 전송. </li><li> 위의 단계를 한 번 더 시간을 반복하고 새로운 Oakridge 튜브에 추출물을 전송. </li><li> 100 % 메탄올 (-20 ° C에 저장된)에서 0.1 M의 암모늄 아세테이트의 5 볼륨을 추가하여 페놀 추출한 단백질을 침전. 하룻밤을위한 -20 ° C에서 소용돌이와 부화. </li><li> 20 분 동안 20,000 XG, 4 ° C에서 원심 분리하여 단백질 펠릿를 수집합니다. </li><li> 80% 차가운 아세톤과 메탄올과 2 번의 차가운 0.1M의 암모늄 아세테이트와 펠릿 2 번 씻으십시오. 펠렛에 1.​​5 ML 차가운 70 % 에탄올을 추가하고 일시 중지합니다. 20 분 동안 2 ML의 microcentrifuge 튜브 (미국 과학) 및 14,000 rpm으로 원심 분리기, 4 ° C로 전송합니다. 에탄올을 제거합니다. </li><li> Speed​​Vac 농축기에 펠렛에 간단히 말리도록하며 단백질 extr에 녹아작업 버퍼 예 ReadyPrep 단백질 추출 키트 시약 3 (8 M의 요소, 4 % 챕스, 40 MM 트리스베이스, 2 M 티오 우레아) (바이오 방사선). 펠렛을 형성하기 위해 30 분 동안 14,000 RPM, 20 ° C에서 원심 분리기. 표면에 뜨는를 수집합니다. </li><li> 제조 업체의 설명서 (제노 기술)에 따라 CB-X 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. </li></ol> 4. cysTMTs과 샘플 준비 및 펩타이드의 라벨링 <ol><li> 2-5 μg / μL의 농도에 단백질 샘플을 준비합니다. 자, 각 대규모 태그를 20 μl-50 μL 샘플을 단백질 100 μg을 사용합니다. 본 실험에서는 모두 6 태그가 사용되었습니다. </li><li> 무료 thiol 그룹을 차단하는 단백질 샘플로 알킬화 버퍼의 동일 부피 (100 MM 트리스-HCL pH7.5, 200 MM iodoacetamide)를 추가합니다. 버퍼는 신선 준비되어야한다. 알킬화는 1 시간 동안 37 ° C에서 수행됩니다. </li><li> 하룻밤을위한 -20 ° C에서 차가운 80 % 아세톤 1 ML을 추가하여 단​​백질을 침전. 14,000에서 centrifuging에 의해 펠릿 단백질RPM, 4 ° C에서 20 분입니다. 매번 vortexing 80 % 아세톤으로 펠릿 3 번 씻으십시오. 표면에 뜨는를 제거하고 얼음에 건조 잠시 일입니다 수 있습니다. </li><li> 50 μL 용해 완충액 (6 M의 요소, 50 MM 트리스베이스, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 펠렛을 Resuspend. 100 MM 트리스 (2 - Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) 0.5 μL 그런 다음 실온에서 한 시간 만이라도 잠복기하여 이황화 채권을 줄이기 위해 추가됩니다. </li><li> 태그를 solubilize하는 시약 튜브에 acetonitrile 20 μL를 추가하여 태그를 준비합니다. 와동하고 아래로 내려 봐. </li><li> Microcon 3KD 원심 필터 장치 (Millipore)을 사용하여 추가 TCEP을 씻으십시오. Microcon 3KD 칼럼 50 μL 시료를 추가하고 컬럼 50 μL 용해 완충액. 10,000 XG와 4 ° C.에 15 분 동안 원심 세 번 총 대해이 단계를 반복합니다. 컬럼을 제거하고 깨끗한 튜브로 바꾸란. 1,000 XG와 4 ° C.에서 5 분 동안 원심 </li><li> 산도를 확인합니다. 필요한 경우 1 M HCL과 7.0-8.0에 산도를 조정합니다. </li><li> cysTM 5 μL를 추가하십시오각 샘플 (cysTMT 시약 키트는 최대 500 μg 단백질려면 20 μL 태그를 제공합니다.이 방법은 우리가 태그 중 하나 - 다섯 번째를 사용하므로, 100 μg 단백질을 사용합니다.)에 T 시약. 상온에서 2 시간 동안 진행하는 반응을 허용합니다. </li><li> 샘플은 1:1 비율로 Laemmli 샘플 버퍼 (바이오 방사선)와 결합되었다. </li></ol> 5. 비 반응 태그 샘플 분획화 제거 <ol><li> 샘플은 5 분 동안 끓인와 사전 캐스트 12 % polyacrylamide 겔 (바이오 방사선)에서 분리되었다. 겔은 걸러 H 2 O 5 분 간격으로 세 번 씻어서 1 시간 정도 Coomassie 파랑 (바이오 방사선) 물들일되었습니다. 겔은 H 2 O를 함께 하룻밤 드 묻은였다 </li><li> 정오 분수는 각 겔 차선에서 수집되었다. 분수는 단백질 밴드 농도에 의해 결정됩니다. 분수는 1mm의 조각으로 잘게와 1.5 ML 튜브에 수집되었다. </li><li> 젤 조각 H 2 년 50 % acetonitrile과 0.1 M의 탄산수 소 암모늄을 사용하여 드 묻은 있었다 </서브&gt; O. 블루 색상이 젤 조각 (~ 3-4 회, 15 분마다)에서 제거될 때까지이 단계를 반복해야합니다. </li><li> 드 묻은 겔 조각 15 뜨는 제거한 분, 그리고 Speed​​Vac를 사용하여 건조 조각에 대한 100 % acetonitrile을 (겔 조각을 포함)를 사용하여 건조되었다. </li><li> 25 밀리미터 탄산수 소 암모늄의 동일한 볼륨 (같은 풀링된 레이블 샘플)의 비율 : 1시 10분에서 트립신 (Promega) (단백질의 트립신)를 해산. 예를 들어, 500 μL의 볼륨과 600 μg 단백질 샘플이 25 밀리미터 탄산수 소 암모늄 500 μL에 녹아있는 60 μg의 트립신 필요합​​니다. </li><li> 겔 조각 트립신 솔루션을 추가하고 rehydrate하기 위해 얼음을 설정합니다. 조각이 포함되지 않은 경우 50 밀리미터 탄산수 소 암모늄 버퍼를 추가합니다. rehydration 후 12-16 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> incubated 샘플에서 액체 단백질 추출물을 제거합니다. </li><li> 반응을 중지 5 % 개미의 염산, 50 % acetonitrile과 젤 조각을 포함하여 남아있는 단백질 소화를 제거 .. 객실 테에서 20 분 동안 겔 조각을 흔들어mperature. 5.7에서 추출한 단백질 샘플 튜브에 뜨는을 전송합니다. 두 번 추출 절차를 반복합니다. Speed​​Vac를 사용하여 압축을 푼 펩티드를 건조합니다. </li></ol> 6. cysTMT 라벨-펩티드의 샘플 농축 <ol><li> 50 % 슬러리를위한 0.5 ML 튜브에 안티 - TMT 수지의 그라데이션을 추가합니다. (그라데이션은 분획화 젤의 밴드 농도에서 산출된 것입니다. 분획 컬렉션 어두운 밴드로 구성되어있다면, 더 수지가 필요합니다. 적은 단백질가로 약한 밴드와 분수 덜 수지가 필요합니다.) </li><li> 수지는 다음 1X 중 하나 열 볼륨으로 세 번 씻어있다 트리스 버퍼 염분 (TBS) (25 MM 트리스, 0.15 M NaCl, 산도 7.2) (써모 과학 피어스 단백질 연구 제품). </li><li> 각 시료 200 μL 1xTBS를 추가합니다. 샘플 그런 다음 안티 - TMT 수지 (써모 과학 피어스 단백질 연구 제품)에 추가 및 4 ° C.에서 하룻밤 출렁 이는 다음에 2 시간 동안 실온에서 교반하고 </li><li> 열 (에 샘플을 추가rmo 과학 피어스 단백질 연구 제품). </li><li> 1X 200 μL TBS와 함께 각 열에 세 번 씻는다. 이 후 0.05 %의 챕스 (1X TBS에 녹아있는)로 세 번 세척과 함께옵니다. </li><li> 열은 후 1X TBS 4 M의 요소로 세 번 씻어있다. H 2 O의 이백 microliters 그런 다음 열 세 번 씻어 사용됩니다. </li><li> 각 시료는 200 μL 50 % 용리 완충액 (50 % acetonitrile, 0.4 % TFA)를 세 번 eluted있다. </li><li> 샘플은 다음 진공 농축기로 건조됩니다. </li></ol> 7. 질량 분광법 분석 <ol><li> 0.1 % 개미의 산성으로 3 % acetonitrile 12 μL에서 샘플을 Resuspend하고 Eksigent NanoLC-1D 고압 액체 크로마 토그래피 칼럼 (AB SCIEX, 미국)에 직접 5 μL를 주입. </li><li> 펩티드는 Proteopep II C18 컬럼 75 μm의 ID를 구분됩니다 4-60% 기울기를 (사용 X 20cm (새로운 목표, 미국) : 3 % acetonitrile, 0.1 % 개미의 산성, B : 97 %의 acetonitrile, 0.1 %의 개미 산성)3 μL / 60 분여 분. </li><li> 써모 과학 LTQ Orbitrap XL 질량 분석기는 단일 스테이지 MS 구성된 × 3의 실험은 3 MS이어서 높은 에너지 C-트랩 분리 (HCD) 단편화와 MS / MS 스펙트럼 3의 인수 다음에 가기 2를 사용하여 펩티드를 검색하는 데 사용되었다 단백질 식별을위한 충돌 유발 분해 (CID)와 / MS. 이 모드에서 매개 변수가 있었다 : 절연 폭 : 3.0 M / Z, 충돌 에너지 : 50 % (두 단계로 10 %). 오직 두 곱으로 및 triply - 충전 펩티드는 조각으로 선택되었다. 동적 제외 매개 변수로 설정되었습니다 = 1 세어 반복, 반복 기간 = 60; 제외 목록의 크기 = 500; 제외 기간은 = 28. 다음과 같이 대상 값은 다음과 같습니다 MS = 5 전자 5; MS / MS (HCD) = 1 E 5. 이온 전송 시간은 MS / MS (HCD)에 대한 FTMS 300 500로 설정되었다. 두 microscans은 HCD 스펙트럼이 필요했다. </li></ol> 8. 데이터베이스 검색 및 Quantitation <ol><li> 인수 CID와 HCD 데이터 있었다비율을 수치 리포터 이온 양자 화기 (조각 이온 20 PPM 질량 공차)를 구현 측쇄 워크플로우를 통해 써모 과학 프로테옴의 Discoverer가 소프트웨어 1.2 (써모 과학 피어스 단백질 연구 제품)을 사용 nalyzed. 별도의 세그먼트는 스펙트럼 선택기, 스펙트럼 Normalizer 및 스펙트럼 그룹화 노드를 통해 MS 두 스펙트럼이 처리되었습니다. </li><li> 데이터는 다음 SEQUEST 검색 엔진으로부터 검색되었습니다. 20 PPM 질량 공차가 사용되었습니다. 정적 수정은 cysTMT 시약으로 설정 (304.18 다) 및 동적 수정 인산화 및 메티오닌의 산화를 (15.99 다) 포함되었습니다. Solanum lycopersicum에 대한 사용자 정의 데이터베이스는 RNA 데이터 (하버드 대학에서 약 350,000 항목과) 13이 두 경우에 사용되었다를 사용하여 구성되었습니다. </li></ol> 9. 대표 결과 제어 토마토 식물 잎과 모나스 주사 나뭇잎의 대표 이미지입니다그림 1에 표시된. 처리 제어 및 모나스 취급 나뭇잎 사이의 차이가 관찰된다. 나뭇잎을 제거하고 드 염색법 프로세스가 잎 조직에서 ROS의 흔적 (그림 2)를 표시 histochemical 얼룩을 허용합니다. DAB를 사용 물들일 후 그림 2A 아무 염색법과 제어 나뭇잎의 대표입니다. 그림 2B는 대표 H 2 O 2 생산을위한 모나스와 긍정적인 염색법으로 취급 나뭇잎의. differentially 산화 환원 규제 단백질의 프로테옴 디스 데이터 출력의 예제는 그림 3에 표시됩니다. 이 단백질은 알려진 산화 환원 조절 단백질 ferredoxin-1 14이며, 모나스 syringae PV 토마토 15에 대한 방어 역할을 보여줘왔다. 제어 및 주사 샘플 사이의 피크 강도는 ferredox에 상당한 변화를 보여 상대적 부량를 얻기 위해 사용됩니다에서-1 산화 환원 조절 (P &lt;0.05). 높은 강도 봉우리는이 단백질은 병원균 치료에 대한 응답으로 산화되는 것을 권해드립니다. 그림 4는 컨트롤과 주사 샘플 사이에 단백질의 산화 환원 유사한 규정을 가지고 단백질의 프로테옴 디스 데이터 출력의 예입니다. 유사한 강도의 봉우리는 치료의 변화에​​ 의해 규제되지 이황화 채권의 존재를 제안합니다. 방법은 과학자들이 산화 환원 반응 cysteines 및 disulfides 10을 감지하는 방법 대변혁을 가져올 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> 그림 1. 주사 토마토의 대표 이미지 제어 솔루션 ()와 모나스 (B)로 떠난다. &lt;스팬 클래스 = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> 그림 2. 주사 토마토의 DAB의 염색법의 대표 이미지 제어 솔루션 ()와 모나스 (B)로 떠난다. 낙엽은 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine을 사용 물들어 있었다. 엽록소는 95 % 에탄올에 끓고하여 나뭇잎에서 제거되었습니다. 다크 염색법은 H 2 O 2의 존재를 나타냅니다. 단 박테리아 문화는 어두운 염색법을 보여주 함께 주사 떠난다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> 그림 3. ferredoxin-1의 프로테옴 디스 데이터 출력, differentially 산화 환원 규제 단백질 14 예. 각 피크 위에 피크 강도는 절대 부량에 사용됩니다. 제어 및 주사 샘플 사이의 피크 강도가 사용됩니다상대 부량을 수행합니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> 그림 4. 컨트롤과 주사 샘플 간의 유사 피크 강도를 가진 단백질의 프로테옴 디스 데이터 출력의 예. 유사한 강도의 봉우리는 치료의 변화에​​ 의해 규제되지 이황화 채권의 존재를 제안합니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 프로토콜은 DAB의 염색법을 수행 관한 정보뿐만 아니라 cysTMT 분류 산화 환원 시스테인 부량를 제공합니다. 이러한 절차는 ROS의 생산뿐만 아니라 Solanum lycopersicum는 모나스 syringae으로 주사되는 단백질 규제에 대한 영향을 조사에 유용합니다. 이 프로토콜에 제시된 방법은 잎 조직 손상의 최소 금액을 일으키는 방식으로 전체 잎 샘플에서 ROS를 검사하는 방법을 제공합니다. 라벨 절차는 시스테인 라벨링 방법을 이용하여 잠재적으로 산화 환원 규제 단백질을 검사하는 방법을 제공합니다. 스트레스 반응의 초기 단계 검사 때 유용합니다. 이러한 동위 원소 코딩된 친화 태그 (ICAT)와 cysTMT 같은 방법은 생물 학적 샘플에서 잠재적인 산화 환원 조절 단백질 검사에 사용될 수 있습니다. ICAT는 라벨 두 샘플 12 비교 있습니다. 두 방법 모두 무료 cysteine​​s을 라벨과 quantific 단백질에 사용할 수ation 10,12. 그러나 cysTMT 방법은 실험적인 변형의 감소뿐만 아니라 10 멀티플렉싱을 허용합니다. 사용 가능한 태그의 수는 연구자들이 실험적인 디자인으로 복제하거나 여러 샘플을 포함시킬 수 있습니다. 샘플이 더 많다는 것은 확인된 단백질의 높은 숫자의 가능성을 제공합니다. cysTMT 기법의 가장 큰 단점은 그것 때문에 cysTMT 표시된-펩티드 (6.5-6.6)에 대한 선택적 농축 단계의 단백질 식별의 전반적인 품질을 떨어뜨리고있다는 것입니다. 단백질 식별을위한 펩티드의 수는 단백질 시퀀스에있는 시스테인 잔류물의 수에 따라 크게 달라집니다. 이 문제는 질량 분광법 단백질 식별을 위해 농축 전에 tryptic 샘플의 일부를 제출하여 극복할 수 있습니다. 실험적인 디자인뿐만 아니라 cysTMT 메서드가 활용하는 레이블링 메커니즘의 특성으로 인해 특정 단계가 중요합니다. 단백질 preci을 수행하는 동안pitation 및 펠렛 washings (3.9)은 단백질 저하를 줄이기 위해 얼음을 차게 샘플을 유지하는 것이 중요합니다. 샘플 역방향 라벨을 받다 수 있으므로 cysTMT 라벨 동안 줄이는 시약 (4.6)의 제거가 중요합니다. 시약을 줄이는 것은 표본에 남아있다면 역방향 라벨이 가능합니다. 샘플 라벨 이후에 감소하는 경우 cysTMT 태그는 제거할 수 있습니다. 레이블 샘플에 추가됩니다되면 ph 수준은 최적의 레이블링 효율성을 위해 (4.7) 확인되어야합니다. 또한, 데이터 분석은 연구자와 프로토콜을 사용하는 궁극적인 목표는 요구되는 무엇에 따라 달라집니다. 또한 각각의 소프트웨어가 서로 다른 알고리즘을 가지고 사용중인 소프트웨어에 따라 달라집니다. 이 실험은 토마토의 반응 산화 종 향상된 생산을위한 elicitor와 같은 병원체 활용되지만, 기타 산화 환원 조절 반응이 적절하게 측정할 수 있습니다. 이 실험 설계는 다른 식물과 동물 시스템에 적용할 수있다. </P&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> MetroMix 500 </td><td> BWI 회사 </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-Diaminobenzidine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep 선형 추출 키트 시약 3 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X 단백질 분석 </td><td> 제노 기술 </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT 시약 </td><td> 온도 과학 피어스 단백질 연구 제품 </td><td> 90,071 </td></tr><tr><td> Laemmli 샘플 버퍼 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> 바이오 안전 Comassie (G-250 얼룩) </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3KD 칼럼 </td><td> Millipore </td><td> 42,403 </td></tr><tr><td> 고정화 방지 TMT 수지 </td><td> 온도 과학 피어스 단백질 연구 제품 </td><td> 90,076 </td></tr><tr><td> 원심 칼럼 </td><td> 온도 과학 피어스 단백질 연구 제품 </td><td> 89,896 </td></tr><tr><td> Proteopep II C18 컬럼 </td><td> 새로운 목표 </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90,389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> 써모 과학 </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> Speed​​Vac </td><td> Labconco </td><td> 7,812,013 </td></tr><tr><td> 프로테옴 Discoverer가 1.2 소프트웨어 </td><td> 온도 과학 피어스 단백질 연구 제품 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge의 원심 분리기 튜브 </td><td> 써모 과학 NalgeNE 회사 </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Microcentrifuge 튜브 (2ml) </td><td> 미국 과학 </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% 미니 프로 테우스 TGX 프리 캐스트 젤 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> 양식의 맨 위로 양식&gt; 바이오 안전 Coomassie StainBottom </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT 농축 키트 </td><td> 온도 과학 피어스 단백질 연구 제품 </td><td> 90,077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

모나스 syringae PV. 토마토 스트레인 DC3000은 Arabidopsis thaliana, 유전적으로 취급하기 쉬운 호스트 식물 1,2에 Solanum lycopersicum에서뿐만 아니라 Brassica 종의 세균성 반점 질환의 원인뿐만 아니라뿐만 아니라. DC3000으로 주사 cotyledons의 반응성 산소 종 (ROS)의 축적 토마토 3의 세균성 반점 병 중에 modulating 괴사성 세포 사망의 ROS의 역할을 나타냅니다. 과산화수소, ROS의 구성 요소는 모나스 3 토마토 식물의 접종 후 제작합니다. 과산화수소는 histochemical 얼룩 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine (DAB) 4를 사용하여 감지가 가능하다. DAB의 염색법은 잎 조직 4 얼룩 갈색을 생성하는 과산화수소와 반응. ROS는 5 특정 단백질의 산화 환원 상태를 변경할 수 세포 산화 환원 환경의 규제 역할을하고 있습니다. 시스테인은에 민감한 중요한 아미노산이다산화 환원 변경됩니다. 온화한 산화에서 시스테인 sulfhydryl 그룹의 가역 산화은 생리적 과정 6,7의 다양한 규제 산화 환원 센서 및 신호 변환기 역할을한다. 탠덤 질량 태그 (TMT) 시약이 동시 신분증을 활성화하고 탠덤 질량 분광법 8,9를 사용하여 서로 다른 샘플에서 단백질의 quantitation를 멀티플렉싱. 시스테인, 반응 TMT (cysTMT) 시약은 선택 라벨링과 상대적 quantitation 시스테인 함유 여섯 생물 학적 샘플이 최대의 펩티드을 가능하게합니다. 각 isobaric cysTMT 태그는 같은 명목 부모가 질량을 가지고 있으며, sulfhydryl, 반응 그룹, MS-중립 스페이서 팔과 MS / MS 기자는 10로 구성되어 있습니다. 라벨 후, 샘플 테아제 소화에 따라 달라질 수 있었다. 시스테인-라벨이 펩티드는 안티 TMT 항체를 포함하는 수지를 사용하여 풍부하게되었다. MS / MS 분석을하는 동안 기자 이온 일련의 (예 : 126-131 다)는 상대적 quantitation에 대한 정보를 제공하고, 낮은 대량 지​​역에서 등장.작업 흐름, 샘플 복잡도를 줄이고 동적 범위 향상과 시스테인 수정 사항을 공부에 대한 효과적입니다. 여기서 우리가 PST DC3000 취급 토마토의 산화 환원 proteomic 분석을 제시 (리오 그란데) cysTMT 기술을 사용하여 떠난다. 이것은 높은 처리량 방법은 다른 산화 환원 - 규제 생리적 과정을 연구에 적용할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.

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Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

세포가 스트레스 조건을 만났을때 반응 산소 종 수준이 상승하고 있습니다. 여기 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine의 염색법의 예제뿐만 아니라 산화 환원 프로테옴을 프로파일하기 위해 cysTMT 라벨 및 질량 분광법을 보여<em&gt; 모나스 syringae</em&gt; 토마토 잎사귀를 치료.

동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

profiling-thiol-redox-proteome-using-isotope-tagging-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

연구

생물학

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

전기 분무 이온화 질량 분광법을 사용하여 효모 Lipidome의 양적 평가

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

절대 단백질 정량 질량 분석을 모니터링 선정 반응

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...