Name: profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke dr. Greg Martin (Cornell University) og hans gruppe for å gi DC3000 belastningen, tomat frø og råd. De vil også gjerne takke Dr. Zhonglin Mou for hjelp med DAB protokollen og Proteomikk divisjon ved UF tverrfaglig senter for bioteknologi Forskning for bistand til metodeutvikling. Protokollen for protein utvinning ble endret fra Hurkman og Tanaka 16. Protokollen på cysTMT merking, trinn 4 til 6 ble tilpasset basert på den opprinnelige Thermo Pierce Fisher Scientific produktmanualen 17. Dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation (MCB 0.818.051 til S Chen).

1. Økende Seedlings og forbereder Bakterier <ol><li> Spirene spirer i MetroMix 500 jord blanding (BWI ​​Selskaper) i en vekst kammer (160 mikromol fotoner m -2 s -1 med en daglengde på 8 timers lys ved 22 ° C og 16 timers mørke ved 20 ° C i 1 uke. Relativ fuktighet ble satt til 70%. Seedlings ble vannes med vann fra springen som nødvendig for å holde jorda fra å bli tørr. </li><li> To frøplanter av samme størrelse blir deretter transplantert til 4 &quot;diameter potter inneholder MetroMix 500 jord og vokst i ytterligere 3 uker på de samme vilkår som 1,1. </li><li> Pseudomonas syringae (PST) er i utgangspunktet T-stripete på Kings B Medium (KBM) plater per liter: 20 g Proteose Peptone, 0,1975 g MgSO 4, 1% Glyserol, 1,5 g K 2 4 HPO, 18 g Agar) og vokst for to dager på 28 ° C. En enkelt koloni blir samlet inn, blandet inn 300μl flytende Kings B Medium (20 g Proteose pepton, 0,1975 g MgSO 4 </sub&gt;, 10 ml Glyserol, 10 ml 100x K 2 HPO 4 lager (1,5 g K 2 HPO 4 i 10 mL H 2 O), og spredt på en Kings B Medium plate. Dette er dyrket over natten ved 28 ° C. </li><li> Den bakterier podestoff er utarbeidet ved å skrape dyrkede bakterier fra KBM platen inn 20 mL H 2 O. En OD 600 av 0.03 (~ 10 6 cfu / ml) er utarbeidet i en L av inokulasjon buffer (10 mM MgCl 2 + 400 mL Silwett-70). Inokulasjon buffer minus bakterier ble utarbeidet for kontrollen løsning. </li></ol> 2. Inokulering av Tomato med PST og H 2 O 2 histochemical Stain <ol><li> Fire ukers gamle anleggene ble inokulert ved dypping i ovennevnte inokulasjon løsningen i 30 sekunder. Klare plastposer ble satt over plantene umiddelbart etter inokulasjon. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine (DAB) flekke 11 ble utarbeidet (1 mg / ml DAB i H 2 O, pH 3,8 (HCl)) tre days før bruk for å oppnå fullstendig solubilization. Løsningen ble vugget å blande ved romtemperatur. </li><li> Tjuefire timer etter behandlingen, ble det fullt utvidet bladet fjernet, plassert i DAB flekken epidermal siden opp, og vakuum infiltrert i 15 min. Bladene ble deretter satt i mørke ved romtemperatur over natten for farging. </li><li> Bladene ble kokt i 95% etanol i 10 min, og deretter holdt i 75% etanol. </li></ol> 3. Protein Extraction <ol><li> Etter høsting, ble tomatblader malt opp til fint pulver med flytende nitrogen ved hjelp morter. </li><li> For 0,5 g vev, legger 1,25 mL Tris pH 8,8 bufret fenol og 1,25 ml / 0,5 g utvinning buffer (0,1 M Tris-HCl 8,8 pH, 10 mM EDTA, 0,9 M sukrose) fortsett deretter sliping for et par mer min i en avtrekksskap. </li><li> Overfør ekstrakt til Oakridge sentrifugerør (Thermo Fisher Scientific Nalgene Company) og agitere for 2 timer ved romtemperatur. </li><li> Sentrifuger ved 5000 xgog 15 ° C i 10 min. Overfør toppen fenol fase til en ny rent rør. </li><li> Back-pakke den vandige fasen med lik volum ut fenol buffer, Rør på en shaker for 30 min. Sentrifuger og overfør ekstraktet til en ny Falcon tube. </li><li> Gjenta trinnet ovenfor en gang til og overføre ekstrakt til nye Oakridge tube. </li><li> Bunnfall fenol utvunnet proteiner ved å legge 5-volumer på 0,1 M ammonium acetat i 100% metanol (lagret ved -20 ° C). Vortex og Inkuber ved -20 ° C for natten. </li><li> Samle protein pellet ved sentrifugering ved 20.000 xg, 4 ° C i 20 min. </li><li> Vask pellet 2 ganger med kulde 0.1m ammonium acetat i metanol og 2 ganger med 80% kald aceton. Tilsett 1,5 ml kaldt 70% etanol til pellets og suspendere. Overføring til en 2 mL mikrosentrifuge tube (USA Scientific) og sentrifuger ved 14 000 rpm, 4 ° C i 20 min. Fjern etanol. </li><li> Tørk pelleten kort i en SpeedVac konsentrator og oppløses i et protein, trinnhandling buffer, f.eks ReadyPrep Protein Extraction Kit reagens 3 (8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris-base, 2 M Thiourea) (Bio-Rad). Sentrifuger ved 14 000 rpm og 20 ° C i 30 min å danne en pellet. Samle supernatanten. </li><li> Mål protein konsentrasjon med en CB-X protein analysen i henhold til produsentens håndbok (Geno Technology). </li></ol> 4. Prøveopparbeidelse og Peptide merking med cysTMTs <ol><li> Forbered protein prøven i en konsentrasjon på 2-5 mikrogram / mL. Her bruker vi 100 mikrogram av protein for hvert masse tag, 20 mL-50 mL prøver. For dette eksperimentet alle 6 tagger ble brukt. </li><li> Legg tilsvarende volum alkylering buffer (100 mM pH7.5 Tris-HCl, 200 mm iodoacetamide) til proteinet prøven å blokkere den frie tiol gruppen. Buffer bør være forberedt frisk. Alkylering utføres ved 37 ° C i 1 time. </li><li> Bunnfall proteinet ved å legge en ml kaldt 80% aceton ved -20 ° C for natten. Pellet proteinet ved sentrifugering på 14 000rpm, 4 ° C i 20 min. Vask pellet 3 ganger med 80% Aceton virvling hver gang. Fjern supernatanten og la det lufttørke mens du er på isen. </li><li> Resuspender det pellet i 50 mL lysis buffer (6 M Urea, 50 mM Tris base, 1 mm EDTA). 0,5 mL av 100 mm Tris (2-Carboxyethyl) Fosfin (TCEP) legges deretter til å redusere disulfide obligasjoner ved å inkubere en time ved romtemperatur. </li><li> Forbered koder ved å legge 20 mL av acetonitril til reagenset rør til solubilize kodene. Vortex og spinner ned til bunnen. </li><li> Vaske ut ekstra TCEP bruker en Microcon 3KD sentrifugalfilter enheten (Millipore). Tilsett 50 mL prøve å Microcon 3KD kolonne, og 50 mL lysis buffer til kolonnen. Sentrifuger i 15 min ved 10 000 xg og 4 ° C. Gjenta dette trinnet for totalt tre ganger. Fjern kolonne og invertere til et rent rør. Sentrifuger i 5 min ved 1000 xg og 4 ° C. </li><li> Sjekk pH. Hvis nødvendig, juster pH-verdien til 7,0 til 8,0 med 1 M HCl. </li><li> Tilsett 5 mL av cysTMT reagens til hver prøve (The cysTMT reagenssett gir 20 mL koder for opp til 500 mikrogram protein. Denne metoden bruker 100 mikrogram protein, derfor bruker vi en femtedel av koden.). La reaksjonen til å fortsette for to timer ved romtemperatur. </li><li> Prøvene ble kombinert med Laemmli Sample buffer (Bio-Rad) i forholdet 1:1. </li></ol> 5. Fjerning av ikke-reagerte Tag Sample Fraksjonering <ol><li> Prøvene ble kokt i 5 min og deles på en pre-cast 12% polyakrylamid gel (Bio-Rad). Gelen ble skylt tre ganger i 5 minutters intervaller med filtrert H 2 O og farget med Coomassie Blue (Bio-Rad) for 1 time. Gelen ble de-beiset natten med H 2 O. </li><li> Tolv fraksjoner ble samlet inn fra hver gel kjørefelt. Brøker ble bestemt av protein bandet konsentrasjoner. Brøker ble kuttet opp i biter 1mm og samlet inn en 1,5 ml rør. </li><li> Gel stykker var de-beiset med 50% acetonitril og 0,1 M ammonium bikarbonat i H 2 </sub&gt; O. Dette trinnet må gjentas inntil blå farge er fjernet fra gel stykker (~~~HEAD=NNS 3-4 ganger, 15 min hver gang). </li><li> De Fargede gel stykkene ble tørket ved hjelp av 100% acetonitril (dekker gel stykker) i 15 min, supernatanten fjernet, og bitene tørkes med en SpeedVac. </li><li> Løs trypsin (Promega) på 1:10 (trypsin: protein) ratio i samme volum (som samlet merket prøven) av 25 mM ammonium bikarbonat. For eksempel, trenger 600 mikrogram protein prøve med et volum på 500 mL 60 mikrogram trypsin oppløst i 500 mL av 25 mM ammonium bikarbonat. </li><li> Legg til trypsin løsning til gel stykker og satt på is for å rehydrere. Hvis brikkene ikke er dekket tilsett 50 mM ammonium bikarbonat buffer. Etter rehydrering, inkuber ved 37 ° C i 12-16 timer. </li><li> Fjern væsken protein ekstrakt fra inkuberte prøvene. </li><li> Stopp reaksjonen og fjern eventuelle gjenværende protein fordøye ved å dekke gel stykker med 5% maursyre, 50% acetonitril .. Rist gel stykker for 20 min på rommet temperature. Overfør supernatanten til de utpakkede protein prøverør fra 5,7. Gjenta ekstraksjonsmetode to ganger. Tørk de utpakkede peptider ved hjelp av SpeedVac. </li></ol> 6. Eksempel Anrikning av cysTMT Merkede-peptider <ol><li> Legg til en gradient av anti-TMT resin til 0,5 ml rør for en 50% slurry. (Gradient ble bestemt fra bandet konsentrasjon i fraksjonering gel. Hvis en brøkdel samling består av en mørk band, er mer harpiks nødvendig. Brøker med svakere bånd krever mindre harpiks som det er mindre protein.) </li><li> Harpiksen er deretter vasket tre ganger med en kolonne volum av 1x Tris-bufret saltvann (TBS) (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, 7,2 pH) (Thermo Scientific Pierce Protein Forskning Products). </li><li> Tilsett 200 mL 1xTBS til hver prøve. Prøver blir deretter lagt til anti-TMT resin (Thermo Scientific Pierce Protein Forskning Products) og opphisset ved romtemperatur i 2 timer etterfulgt av rocking natten ved 4 ° C. </li><li> Legg prøve til kolonne (TheRMO Vitenskapelige Pierce Protein Forskning produkter). </li><li> Vask hver kolonne tre ganger med 1x 200 mL TBS. Dette blir så fulgt med vask tre ganger med 0,05% CHAPS (oppløst i 1x TBS). </li><li> Kolonnen blir deretter vasket tre ganger med 4 M urea i 1x TBS. To hundre mikroliter H 2 O blir så brukt til å vaske kolonne tre ganger. </li><li> Hver prøve er eluted tre ganger med 200 mL 50% eluering buffer (50% acetonitril, 0,4% TFA). </li><li> Prøver blir deretter tørket i et vakuum konsentratoren. </li></ol> 7. Massespektrometri Analyse <ol><li> Resuspender prøvene i 12 mL av 3% acetonitril med 0,1% maursyre og injisere 5 mL direkte på en Eksigent NanoLC-1D høytrykk væskekromatografi kolonne (AB SCIEX, USA). </li><li> Peptider vil bli separert på en Proteopep II C18 kolonne 75 mikrometer ID x 20 cm (nytt mål, USA) ved hjelp av en 4-60% stigning (A: 3% acetonitril, 0,1% maursyre, B: 97% acetonitril, 0,1% maursyre syre)på 3 mL / min over 60 min. </li><li> En Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL massespektrometer ble brukt til å påvise peptider ved hjelp av en topp 2 x 3 eksperiment bestående av ett trinns MS etterfulgt av oppkjøpet av tre MS / MS spektra med høyere energi C-felle dissosiasjon (HCD) fragmentering etterfulgt av tre MS / MS med kollisjon indusert dissosiasjon (CID) for protein identifikasjon. Parametere i denne modusen var: Isolation bredde: 3,0 m / z; Kollisjon energi: 50% (10% med to trinn). Bare dobbelt-og triply-ladede peptider ble valgt for fragmentering. Dynamiske eksklusjon parametre ble satt til: Gjenta telle = 1; Gjenta Varighet = 60; Eksklusjonsliste size = 500; Utelukkelse varighet = 28. Målverdier er som følger: MS = 5 E 5; MS / MS (HCD) = 1 e fem. Ion transfer ganger ble satt til 500 for FTMS og 300 for MS / MS (HCD). To microscans var nødvendig for HCD spektra. </li></ol> 8. Database Søker og kvantifisering <ol><li> De oppkjøpte Cid og HCD data var ennalyzed bruker Thermo Scientific Proteome Discoverer programvare 1.2 (Thermo Scientific Pierce Protein Forskning produkter) gjennom en forgrenet arbeidsflyt som implementert en reporter Ion Quantizer (20 ppm masse toleranse av fragment ioner) å kvantifisere forholdet. En separat segment behandlet MS 2 spektra gjennom Spectrum Selector, Spectrum Normalizer, og Spectrum grouper noder. </li><li> Data ble deretter søkte mot SEQUEST søkemotor. En 20 ppm masse toleranse ble brukt. Statiske modifikasjoner ble satt til cysTMT reagens (304,18 Da) og dynamiske modifikasjoner inkludert fosforylering og metionin oksidasjon (15,99 Da). En tilpasset database for Solanum lycopersicum ble komponert ved hjelp av RNA-data (med ca 350 000 oppføringer fra Harvard University) 13 ble brukt i begge tilfeller. </li></ol> 9. Representative Resultater En representant bilde av en kontroll tomatplante blad og en Pseudomonas inokulerte blad ervist i Figur 1. En forskjell mellom kontroll behandles og Pseudomonas behandlet bladene er observert. Etter at bladene er fjernet og farget med DAB, de-farging prosess tillater histochemical flekken å vise tegn til ROS i bladet vev (figur 2). Figur 2A er representant for en kontroll blad uten flekker. Figur 2B er representativ av et blad behandlet med Pseudomonas og positiv farging for H 2 O 2 produksjon. Et eksempel på Proteome Discover data produksjonen av en differensielt redoks regulert protein er vist i figur 3. Dette proteinet er en kjent redoks regulert protein ferredoxin-1 14 og har vist seg å spille en rolle i forsvar mot Pseudomonas syringae pv tomat 15. Peak intensitet mellom kontroll og inokulerte prøver brukes til å oppnå relativ kvantifisering, som viste signifikante endringer i ferredoxi-en redoks regulering (p &lt;0,05). Høyintensitets topper tyder på at dette proteinet er oksidert i reaksjon mot patogen behandling. Figur 4 er et eksempel på Proteome Discover data produksjonen av et protein som har lignende redoks regulering av et protein mellom en kontroll og inokulert prøve. Peaks av lignende intensitet tyder tilstedeværelsen av disulfide obligasjoner ikke regulert av en endring i behandling. Metoden vil revolusjonere hvordan forskerne oppdage redoks responsive cysteines og disulfides 10. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> Figur 1. En representant bilde av inokulert tomatblader med kontroll løsning (A) og Pseudomonas (B). &lt;span class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> Figur 2. Et representativt bilde av DAB farging av inokulert tomatblader med kontroll løsning (A) og Pseudomonas (B). Blader ble farget med 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine. Klorofyll ble fjernet fra bladene ved å koke i 95% etanol. Mørk flekker indikerer tilstedeværelse av H 2 O 2. Bare etterlater inokulert med bakteriekultur viste mørk misfarging. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> Figur 3. Et eksempel på Proteome Discover data utgang av ferredoxin-1, differensielt redoks regulert protein 14. Peak intensitet over hver topp er brukt for absolutt kvantifisering. Peak intensitet mellom kontroll og inokulerte prøver brukeså utføre relativ kvantifisering. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> Figur 4. Et eksempel på Proteome Discover data produksjonen av et protein som har lignende peak intensitet mellom en kontroll og inokulert prøve. Peaks av lignende intensitet tyder tilstedeværelsen av disulfide obligasjoner ikke regulert av en endring i behandling.

<ol>
	<li>Almeida, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).</li><li>Preiter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+virulence+gene+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+strain+DC3000.">Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000.</a> J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).</li><li>Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+of+an+oxidative+burst+during+elicitation+of+cultured+plant+cells:+role+in+defense+and+signal+transduction.">Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction.</a> Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).</li><li>Orozco-Cardenas, M., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+is+generated+systemically+in+plant+leaves+by+wounding+and+systemin+via+the+octadecanoid+pathway.">Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6553-6557 (1999).</li><li>Tonks, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+redux:+revisiting+PTPs+and+the+control+of+cell+signaling.">Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling.</a> Cell. 121, 667-670 (2005).</li><li>Alvarez, S., Wilson, G. H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+disulfide-bonded+proteins+in+Arabidopsis.">Determination of in vivo disulfide-bonded proteins in Arabidopsis.</a> J. Chromatogr. B. 877, 101-104 (2009).</li><li>Apel, K., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species:+metabolism,+oxidative+stress,+and+signal+transduction.">Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 55, 373-399 (2004).</li><li>Dayon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+proteins+in+human+cerebrospinal+fluids+by+MS/MS+using+6-+plex+isobaric+tags.">Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6- plex isobaric tags.</a> Anal. Chem. 80, 2921-2931 (2008).</li><li>Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cysteine-reactive+tandem+mass+tag+reagent+for+subproteome+labeling,+enrichment+and+quantitation.">A novel cysteine-reactive tandem mass tag reagent for subproteome labeling, enrichment and quantitation.</a> , TP169 (2010).</li><li>Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+Arabidopsis+mutants:+diaminobenzidine+stain+for+hydrogen+peroxide.">Phenotypic analysis of Arabidopsis mutants: diaminobenzidine stain for hydrogen peroxide.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).</li><li>Sethuraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-Coded+affinity+tag+(ICAT)+approach+to+redox+proteomics:+identification+and+quantification+of+oxidant-sensitive+cysteine+thiols+in+complex+protein+mixtures.">Isotope-Coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: identification and quantification of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures.</a> J. Proteome Res. 3, 1228-1233 (2004).</li><li>Asso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+and+redox+characterization+of+ferredoxins+I+and+II+from+Desulfovibrio+vulgaris+Miyazaki.">EPR and redox characterization of ferredoxins I and II from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 198-204 (1995).</li><li>Huang, H. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+resistance+to+bacterial+pathogens+affected+by+the+amount+of+ferredoxin-I+proteins+in+plants.">Disease resistance to bacterial pathogens affected by the amount of ferredoxin-I proteins in plants.</a> Mol. Plant Pathol. 8, 129-137 (2007).</li><li>Hurkman, W., Tanaka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+plant+membrane+proteins+for+analysis+by+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis.</a> Plant Physiol. 81, 802-806 (1986).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Denne protokollen gir informasjon om hvordan du utfører DAB farging samt cysTMT merket redoks cystein kvantifisering. Disse prosedyrene er gunstig i å undersøke produksjon av ros samt effekt på protein regulering når Solanum lycopersicum er inokulert med Pseudomonas syringae. Metodene som presenteres i denne protokollen gir en måte å undersøke ROS i hele blad prøver på en måte som forårsaker minst mulig skade på blad vev. Merkingen prosedyren gir en måte å undersøke potensielt redoks regulert proteiner ved å benytte en cystein merking metode. Dette er gunstig når du undersøker et tidlig stadium av stressrespons. Metoder som isotop-kodet affinitet tag (ICAT) og cysTMT kan brukes i å undersøke potensielle redoks regulerte proteiner i biologiske prøver. ICAT tillater merking og sammenligning av to utvalg 12. Begge metodene merke frie cysteines og kan brukes for protein quantificasjon 10,12. Imidlertid lar cysTMT metode for en nedgang i eksperimentell variasjon samt multipleksing 10. Antallet koder tilgjengelig tillater forskerne å inkludere replikater eller flere prøver i sin eksperimentelle design. Å ha flere prøver gir mulighet for et høyere antall proteiner identifisert. En stor ulempe av cysTMT teknikken er at den kompromitterer generelle kvaliteten på protein identifikasjon på grunn av de selektive berikelse trinnene for cysTMT merket-peptider (06.05 til 06.06). Antallet peptider for protein identifikasjon avhenger i stor grad av antall cystein rester i protein sekvensen. Dette problemet kan overvinnes ved å sende en del av tryptic prøven før berikelse for massespektrometri protein identifikasjon. På grunn av beskaffenheten av den eksperimentelle design samt merking mekanisme som cysTMT metoden benytter, visse trinn er kritisk. Når du utfører protein presipitation og pellet vask (3,9) er det viktig å holde prøvene kjølt på is for å redusere protein degradering. Under cysTMT merking, er fjerning av å redusere reagensen (4.6) viktig fordi prøvene kan gjennomgå omvendt merking. Omvendt merking er mulig hvis redusere reagens forblir i prøven. Dersom prøvene er redusert etter merking, kan den cysTMT tag bli fjernet. Når etikettene er lagt til prøvene, må pH kontrolleres (4.7) for å få optimal merking effektivitet. I tillegg er dataanalyse avhengig av hva som kreves av forskeren og det ultimate målet i bruk av protokollen. Det er også avhengig av hvilken programvare som blir brukt som hver programvare har ulike algoritmer. Dette eksperimentet benytter patogenet som en elicitor for økt produksjon av reaktive oksidative arter i tomat, men kan andre redoks regulerte responser måles tilsvarende. Dette eksperimentelle designet er tilpasningsdyktig til andre planter og dyr systemer. </p&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> MetroMix 500 </td><td> BWI Selskaper </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-Diaminobenzidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep sekvensiell ekstraksjon kit Reagens 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X protein assay </td><td> Geno Teknologi </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT reagenser </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein forskning produkter </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmli Eksempel Buffer </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Bio-Safe Comassie (G-250 flekken) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3KD kolonne </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> Immobilisert Anti-TMT resin </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein forskning produkter </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> Sentrifuge kolonne </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein forskning produkter </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II C18 kolonne </td><td> Nytt mål </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Proteome Discoverer 1.2 programvare </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein forskning produkter </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge sentrifugerør </td><td> Thermo Scientific Nalgene Firma </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Mikrosentrifuge tube (2ml) </td><td> USA Scientific </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Top of Form &gt; Bio-Safe Coomassie StainBottom av skjema </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT berikelse kit </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein forskning produkter </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

Pseudomonas syringae pv. Tomat stamme DC3000 ikke bare forårsaker bakteriell flisen sykdom i Solanum lycopersicum men også på Brassica arter, samt på Arabidopsis thaliana, en genetisk medgjørlig vertsplanten 1,2. Oppbyggingen av reaktive oksygenforbindelser (ROS) i cotyledons inokulert med DC3000 indikerer en rolle av ros i modulerende nekrotisk celledød i løpet av bakteriell fnugg sykdom av tomat tre. Hydrogen peroxide, en komponent av ros, er produsert etter inokulering av tomatplanter med Pseudomonas tre. Hydrogenperoksid kan oppdages ved hjelp av en histochemical flekk 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine (DAB) 4. DAB farging reagerer med hydrogenperoksid for å produsere en brun flekk på bladet vev 4. ROS har en regulerende rolle den cellulære redoks miljø, som kan endre redoks status av visse proteiner fem. Cystein er en viktig aminosyre følsomme forredoks endringer. Under mild oksidasjon, serverer reversibel oksidasjon av cystein sulfhydryl grupper som redoks sensorer og signal transdusere som regulerer en rekke fysiologiske prosesser 6,7. Tandem masse tag (TMT) reagenser gjør samtidig identifisering og multiplekset kvantifisering av proteiner i ulike prøver ved hjelp tandem massespektrometri 8,9. De cystein-reaktive TMT (cysTMT) reagenser aktivere selektiv merking og relativ kvantifisering av cystein som inneholder peptider fra opptil seks biologiske prøver. Hver isobaric cysTMT tag har samme nominelle forelder masse og er sammensatt av en sulfhydryl-reaktiv gruppe, en MS-nøytral spacer arm og en MS / MS reporter 10. Etter merking ble prøvene gjenstand for protease fordøyelsen. De cystein-merkede peptider ble beriket med en harpiks som inneholder anti-TMT antistoff. Under MS / MS-analyse, en rekke reporter ioner (dvs. 126-131 Da) dukke opp i lav masse regionen, gir informasjon om relativ kvantifisering.Arbeidsflyten er effektive for å redusere prøve kompleksitet, bedre dynamisk omfang og studere cystein modifikasjoner. Her presenterer vi redoks proteomikk analyser av Pst DC3000 behandlet tomat (Rio Grande) forlater hjelp cysTMT teknologi. Denne high-throughput metoden har potensial til å bli brukt til å studere andre redoks-regulerte fysiologiske prosesser.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Reaktive oksygen arter nivå er forhøyet når cellene støter stress forhold. Her viser vi eksempel på 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine farging samt cysTMT merking og massespektrometri for å profilere redoks proteomet i<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Behandlet tomatblader.

Profilering tiol Redox Proteome Bruke Isotope Tagging massespektrometri

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Valgt Reaction Monitoring massespektrometri for Absolute Protein Kvantifisering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Identifisering av myod interactome Bruke Tandem Affinity Rensing Koblet til massespektrometri

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellular Redox Profiling ved hjelp av høy innholdsmikroskopi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...