Name: profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-р Грег Мартин (Cornell University) и его группы для обеспечения DC3000 напряжения, семена томатов и совет. Они также хотели бы поблагодарить д-ра Ма Чжунлинь за помощь в протокол DAB и протеомики отдела в UF Междисциплинарный Центр биотехнологических исследований за помощь в развитии метода. Протокол для извлечения белка была изменена с Hurkman и Танака 16 лет. Протокол о cysTMT маркировки, в нескольких шагах от 4 до 6 была адаптирована на основе оригинальных Thermo Fisher Scientific Пирс руководстве по эксплуатации 17. Эта работа финансировалась Национальным научным фондом (MCB 0818051 на S Chen).

<ol>
	<li>Almeida, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).</li><li>Preiter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+virulence+gene+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+strain+DC3000.">Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000.</a> J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).</li><li>Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+of+an+oxidative+burst+during+elicitation+of+cultured+plant+cells:+role+in+defense+and+signal+transduction.">Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction.</a> Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).</li><li>Orozco-Cardenas, M., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+is+generated+systemically+in+plant+leaves+by+wounding+and+systemin+via+the+octadecanoid+pathway.">Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6553-6557 (1999).</li><li>Tonks, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+redux:+revisiting+PTPs+and+the+control+of+cell+signaling.">Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling.</a> Cell. 121, 667-670 (2005).</li><li>Alvarez, S., Wilson, G. H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+disulfide-bonded+proteins+in+Arabidopsis.">Determination of in vivo disulfide-bonded proteins in Arabidopsis.</a> J. Chromatogr. B. 877, 101-104 (2009).</li><li>Apel, K., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species:+metabolism,+oxidative+stress,+and+signal+transduction.">Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 55, 373-399 (2004).</li><li>Dayon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+proteins+in+human+cerebrospinal+fluids+by+MS/MS+using+6-+plex+isobaric+tags.">Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6- plex isobaric tags.</a> Anal. Chem. 80, 2921-2931 (2008).</li><li>Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cysteine-reactive+tandem+mass+tag+reagent+for+subproteome+labeling,+enrichment+and+quantitation.">A novel cysteine-reactive tandem mass tag reagent for subproteome labeling, enrichment and quantitation.</a> , TP169 (2010).</li><li>Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+Arabidopsis+mutants:+diaminobenzidine+stain+for+hydrogen+peroxide.">Phenotypic analysis of Arabidopsis mutants: diaminobenzidine stain for hydrogen peroxide.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).</li><li>Sethuraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-Coded+affinity+tag+(ICAT)+approach+to+redox+proteomics:+identification+and+quantification+of+oxidant-sensitive+cysteine+thiols+in+complex+protein+mixtures.">Isotope-Coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: identification and quantification of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures.</a> J. Proteome Res. 3, 1228-1233 (2004).</li><li>Asso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+and+redox+characterization+of+ferredoxins+I+and+II+from+Desulfovibrio+vulgaris+Miyazaki.">EPR and redox characterization of ferredoxins I and II from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 198-204 (1995).</li><li>Huang, H. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+resistance+to+bacterial+pathogens+affected+by+the+amount+of+ferredoxin-I+proteins+in+plants.">Disease resistance to bacterial pathogens affected by the amount of ferredoxin-I proteins in plants.</a> Mol. Plant Pathol. 8, 129-137 (2007).</li><li>Hurkman, W., Tanaka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+plant+membrane+proteins+for+analysis+by+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis.</a> Plant Physiol. 81, 802-806 (1986).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Этот протокол содержит информацию о выполнении окрашивания DAB, а также cysTMT помечены окислительно-восстановительных количественного цистеин. Эти процедуры полезны при изучении производства АФК, а также влияет на белок регулирования, когда Solanum Lycopersicum прививают Pseudomonas syringae. Методы, представленные в данном протоколе дают возможность изучить АФК в образцах цельной лист таким образом, что вызывает наименьшее количество повреждений ткани листа. Процедура маркировки дает возможность изучить потенциально окислительно-восстановительных регулируется белками, используя метод цистеин маркировки. Это полезно при изучении ранней стадии стресса. Такие методы, как изотоп кодировкой близость тег (ICAT) и cysTMT могут быть использованы при изучении окислительно-восстановительный потенциал регулируемых белков в биологических образцах. ICAT позволяет маркировки и сравнения двух образцов 12. Оба способа обозначения свободного цистеина и может быть использован для белка quantificЦ И А Ц 10,12. Тем не менее, cysTMT метод позволяет при уменьшении экспериментальных изменений, а также мультиплексирование 10. Количество тегов позволяет исследователям включить репликацию или несколько образцов в свои экспериментальные разработки. Имея более образцов обеспечивает потенциал для большего количества белков идентифицированы. Основным недостатком cysTMT техники является то, что она ставит под угрозу общее качество идентификации белков в связи с селективным шаги обогащения cysTMT помечены-пептидов (6.5-6.6). Число пептидов для идентификации белков во многом зависит от количества остатков цистеина в белковой последовательности. Эта проблема может быть преодолена путем подачи части триптического образца до массового обогащения идентификации белков-спектрометрии. В связи с характером опытно-конструкторских, а также маркировка механизм, который использует метод cysTMT, определенные шаги являются критическими. При выполнении белком прецизионныхpitation и гранул стирок (3.9), важно сохранить образцы охлажденной на льду по сокращению деградации белка. В маркировке cysTMT, удаление снижения реагентов (4.6) важно, потому что образцы могут подвергаться обратная маркировка. Обратный маркировки возможно, если снижение реагент остается в образце. Если образцы снижаются после маркировки, тег cysTMT могут быть удалены. После того, метки будут добавлены в образцах, уровень рН должен быть проверен (4.7), чтобы иметь оптимальную эффективность маркировки. Кроме того, анализ данных, зависит от того, что требуется от исследователя и конечная цель в использовании протокола. Это также зависит от используемого программного обеспечения, поскольку каждая программа имеет различные алгоритмы. Этот опыт используется в качестве возбудителя элиситор для расширения производства реактивных окислительных видов помидоров, однако, и другие окислительно-восстановительные регулируемых ответы могут быть измерены соответственно. Этот экспериментальный дизайн адаптируется к другим растений и животных. </р&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Metromix 500 </td><td> BWI компаний </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-диаминобензидина </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep Последовательная реагентов добыча 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X белка анализа </td><td> Гено технологии </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT реагентов </td><td> Thermo Scientific Пирс Продукты белка РАН </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmli Пример буфера </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Био-Safe Comassie (G-250 пятна) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Микроконтроллер 3KD колонка </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> Иммобилизованными анти-TMT смолы </td><td> Thermo Scientific Пирс Продукты белка РАН </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> Центрифуга колонка </td><td> Thermo Scientific Пирс Продукты белка РАН </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II C18 колонка </td><td> Новые цели </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D ВЭЖХ </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> КТЛ Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Протеом Discoverer 1.2 Программное обеспечение </td><td> Thermo Scientific Пирс Продукты белка РАН </td><td></td></tr><tr><td> Трипсин </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge центрифуги трубы </td><td> Thermo Scientific Nalgeпе компании </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Микроцентрифуга трубки (2 мл) </td><td> США Научная </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% мини-изменчивый TGX сборных гель </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Начало формы &gt; Bio-Safe Кумасси StainBottom Формы </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT обогащения комплект </td><td> Thermo Scientific Пирс Продукты белка РАН </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

Pseudomonas syringae ру. Томатного штамма DC3000 не только вызывает бактериальное заболевание пятнышко в Solanum Lycopersicum, но и от вида Brassica, а также на Arabidopsis THALIANA, генетически послушный 1,2 растения-хозяина. Накопление активных форм кислорода (АФК) в семядолях засевают DC3000 указывает на роль АФК в модуляции некротической гибели клеток при бактериальных заболеваний пятнышко помидор 3. Перекись водорода, входящего в состав АФК, производится после прививки растений томатов с Pseudomonas 3. Перекись водорода может быть обнаружены с помощью гистохимических пятно 3&#39;-3 &#39;диаминобензидина (DAB) 4. DAB окрашивания реагирует с пероксидом водорода для получения коричневого пятна на 4 тканях листа. АФК имеет регулирующую роль клеточных окислительно-восстановительных окружающей среды, которые могут изменить окислительно-восстановительный статус некоторых белков 5. Цистеин является важной аминокислотой, чувствительных кокислительно-восстановительных изменений. Под мягким окислением, обратимое окисление сульфгидрильных групп цистеина является окислительно-восстановительных датчиков и преобразователей сигналов, которые регулируют различные физиологические процессы, 6,7. Тандем массы тег (TMT) реагенты позволяют одновременное выявление и мультиплексный количественный белков в различных образцов с использованием тандемной масс-спектрометрии 8,9. Цистеин-реактивного TMT (cysTMT) реагенты позволяют селективной маркировки и относительной количественного цистеин-содержащие пептиды до шести биологических образцов. Каждый тег изобарических cysTMT имеет такую ​​же номинальную массу родителей и состоит из сульфгидрильных-реактивной группой, MS-нейтральный Spacer руку и MS / MS Репортер 10. После маркировки, образцы подвергались протеазы пищеварения. Цистеин-меченные пептиды были обогащены использованием смолы, содержащей анти-TMT антител. В MS / MS анализа, ряд репортер ионов (например, 126-131 Да) появляются в области низких масс, предоставление информации о относительный количественный.Рабочий процесс является эффективным для снижения сложности образца, улучшение динамического диапазона и изучение цистеина модификаций. Здесь мы представляем окислительно-восстановительных протеомных анализ Pst DC3000 лечение помидор (Rio Grande) оставляет использованием cysTMT технологии. Такая высокая пропускная способность метода есть потенциал, чтобы быть применены к изучению других редокс-регулируемых физиологических процессов.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Реактивный уровень кислорода повышается, когда клетки сталкиваются стрессовых условиях. Здесь мы показываем пример 3&#39;-3 &#39;диаминобензидина окрашивания, а также cysTMT маркировки и масс-спектрометрии для профилирования окислительно-восстановительных протеома в<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Лечение листьев томата.

Профилирование тиоловых Редокс Протеом Использование изотопной масс-спектрометрии тегов

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Количественная оценка Дрожжи Lipidome использованием Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Анализ Большие белковые комплексы структурных масс-спектрометрии

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

Oligo массовой Профилирование (ОЛИМП) из внеклеточных полисахаридов

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Прямой анализ отдельных клеток методом масс-спектрометрии при атмосферном давлении

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Профилирование метилтрансферазы и других S-Аденозил- L-Гомоцистеин-связывающих белков Захват соединения масс-спектрометрия (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Количественная оценка Белки Использование пептидов обогащению иммуноаффинной В сочетании с масс-спектрометрии

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Выбранный мониторинга реакций масс-спектрометрии для абсолютного белка количественной

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Идентификация MyoD интерактомные Использование Тандем Аффинная очистка В сочетании с масс-спектрометрии

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Сотовая редокс-профилирование с использованием высококонцентрированной микроскопии

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...