Name: profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Greg Martin (Cornell University) och hans grupp för att tillhandahålla DC3000 stammen, frön tomat och råd. De skulle också vilja tacka Dr Zhonglin Mou för hjälp med DAB protokollet och Proteomics Division på UF tvärvetenskapligt centrum för bioteknik Forskning för stöd i metodutveckling. Protokollet för proteinextraktion ändrades från Hurkman och Tanaka 16. Protokollet om cysTMT märkning, steg 4 till 6 har anpassats baserat på den ursprungliga Thermo Pierce Fisher Scientific produkthandboken 17. Detta arbete har finansierats av National Science Foundation (MCB 0.818.051 till S Chen).

1. Växande plantor och preparera bakterier <ol><li> Groddplantor groddes i MetroMix 500 jordblandning (BTI Företag) i en tillväxtkammare (160 ^ mol fotoner m -2 ar -1 med en fotoperiod av 8 timmars ljus vid 22 ° C och 16 timmars mörker vid 20 ° C under 1 vecka. Relativ fuktighet var inställd på 70%. Plantor vattnades med kranvatten efter behov för att hålla jorden från att bli torr. </li><li> Två småplantor av liknande storlek transplanteras sedan till 4 &quot;diameter krukor innehållande MetroMix 500 jord och odlades under ytterligare 3 veckor under samma betingelser som 1,1. </li><li> Pseudomonas syringae (Pst) är initialt t-ströks på Kings B Medium (KBM) plattor (per liter: 20 g proteospepton, 0,1975 g MgSO 4, 1% glycerol, 1,5 g K 2 HPO 4, 18 g agar) och odlades under två dagar vid 28 ° C. En enda koloni uppsamlas, blandas in i 300 ^ vätska Kings B-medium (20 g proteospepton, 0,1975 g MgSO 4 </sub&gt;, 10 ml glycerol, 10 ml 100x K 2 HPO 4 lager (1,5 g K 2 HPO 4 i 10 ml H 2 O), och spreds på en Kings B Medium plattan. Detta odlades över natten vid 28 ° C. </li><li> Bakterien ympämnet framställes genom att skrapa de odlade bakterierna från KBM plattan i 20 ml H2O En OD 600 av 0,03 (~ 10 6 cfu / ml) framställs i 1 L av ympning buffert (10 mM MgCl2 + 400 | il Silwett-70). Inokuleringsbuffert minus bakterier iordningställda för att reglera lösningen. </li></ol> 2. Ympning av tomat med Pst och H 2 O 2 Histokemisk Stain <ol><li> Fyra veckor gamla plantor inokulerades genom doppning i den ovan inokulering lösningen under 30 sekunder. Tydliga plastpåsar sattes över växterna omedelbart efter ympningen. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobensidin (DAB) fläck 11 framställdes (1 mg / ml DAB i H2O, pH 3,8 (HCl)) tre diays använda innan för att uppnå fullständig upplösning. Lösningen skakades för att blanda vid rumstemperatur. </li><li> Tjugofyra timmar efter behandlingen var helt expanderade bladet bort, placeras i DAB bets epidermal uppåt, och vakuum infiltrerat i 15 min. Bladen placerades därefter i mörker vid rumstemperatur över natten för färgning. </li><li> Bladen kokades i 95% etanol under 10 min, och hölls sedan i 75% etanol. </li></ol> 3. Proteinextraktion <ol><li> Efter skörd togs tomatblad maldes till fint pulver med flytande kväve med användning av mortel och mortelstöt. </li><li> För 0,5 g vävnad, tillsätt 1,25 ml Tris, pH 8,8 buffrad fenol och 1,25 ml / 0,5 g extraktionsbuffert (0,1 M Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM EDTA, 0,9 M sackaros) och därefter fortsätta målning under ytterligare några minuter i en dragskåp. </li><li> Överför extraktet till Oakridge centrifugrör (Thermo Fisher Scientific Nalgene Company) och agitera för 2 timmar vid rumstemperatur. </li><li> Centrifugera vid 5000 xgoch 15 ° C under 10 minuter. Överföra den översta fenol fasen till ett nytt rent rör. </li><li> Back-extrahera vattenfasen med lika stor volym fenol extraherade buffert; skaka på en skakanordning under 30 min. Centrifugera och överför extraktet till en ny Falconrör. </li><li> Upprepa ovanstående steg en gång och överföra extraktet till ny Oakridge rör. </li><li> Utfälla fenol extraherade proteinerna genom tillsats av 5 volymer 0,1 M ammoniumacetat i 100% metanol (lagrad vid -20 ° C). Vortexa och inkubera vid -20 ° C under natten. </li><li> Uppsamling av proteinet pelleten genom centrifugering vid 20.000 xg, 4 ° C under 20 minuter. </li><li> Tvätta pelleten 2 ggr med kall 0,1 M ammoniumacetat i metanol och 2 gånger med 80% kall aceton. Tillsätt 1,5 ml kall 70% etanol till pellets och suspendera. Överföring till en 2 ml mikrocentrifugrör (USA Scientific) och centrifugera vid 14000 rpm, 4 ° C under 20 minuter. Avlägsna etanol. </li><li> Torka pelleten i korthet i en SpeedVac-koncentrator och upplösas i ett protein Extrhandling buffert, t.ex. ReadyPrep Protein Extraction Kit Reagens 3 (8 M urea, 4 viktprocent CHAPS, 40 mM Tris-bas, 2 M tiokarbamid) (Bio-Rad). Centrifugera vid 14000 rpm och 20 ° C under 30 min för att bilda en pellet. Samla upp supernatanten. </li><li> Mäta proteinkoncentration med användning av en CB-X-protein-analysen enligt tillverkarens manual (Geno Technology). </li></ol> 4. Provberedning och peptid märkning med cysTMTs <ol><li> Framställ proteinprov i en koncentration av 2-5 pg / pl. Här används 100 | ig protein för varje massa-tagg, 20 | il-50 jil prover. För detta experiment alla 6 hade använts. </li><li> Tillsätt lika stor volym av alkylering buffert (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 200 mM jodacetamid) till proteinprovet att blockera den fria tiolgruppen. Bufferten bör beredas på nytt. Alkyleringen utförs vid 37 ° C under 1 timme. </li><li> Fälla ut proteinet genom tillsats av 1 ml kall 80% aceton vid -20 ° C under natten. Pelleten proteinet genom centrifugering vid 14.000rpm, 4 ° C under 20 minuter. Tvätta pellet 3 gånger med 80% aceton virvling varje gång. Avlägsna supernatanten och fick lufttorka under på is. </li><li> Återsuspendera pelleten i 50 pl lysbuffert (6 M urea, 50 mM Tris-bas, 1 mM EDTA). 0,5 ^ il av 100 mM Tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP) tillsätts sedan för att reducera disulfidbindningarna genom att inkubera under en timme vid rumstemperatur. </li><li> Framställa taggar genom tillsats av 20 | il av acetonitril till reagensrören att solubilisera de taggar. Vortexa och centrifugera ner till botten. </li><li> Tvätta ut extra TCEP med användning av en Microcon 3KD centrifugalfilter anordning (Millipore). Tillsätt 50 pl prov till Microcon 3KD kolonn och 50 | il lysbuffert till kolonnen. Centrifugera i 15 min vid 10.000 xg och 4 ° C. Upprepa detta steg för totalt tre gånger. Ta bort kolumn och invertera i ett rent rör. Centrifugera under 5 min vid 1000 x g och 4 ° C. </li><li> PH kontrolleras. Vid behov, justera pH till 7,0-8,0 med 1 M HCl. </li><li> Tillsätt 5 | il av den cysTMT reagens för varje prov (The cysTMT reagenskit ger 20 pl taggar för upp till 500 g protein. Denna metod använder 100 g protein, därför använder vi en femtedel av taggen.). Låta reaktionen fortskrida under 2 h vid rumstemperatur. </li><li> Prover kombinerades med Laemmli provbuffert (Bio-Rad) i en 1:1-förhållande. </li></ol> 5. Borttagning av icke reagerade-Tag Sample Fractionation <ol><li> Proverna kokades under 5 min och separerades på en förtillverkad 12% polyakrylamidgel (Bio-Rad). Gelén sköljdes tre gånger i 5 minuters intervaller med filtrerades H2O och färgades med Coomassie Blue (Bio-Rad) under 1 timme. Gelén var de-färgades över natten med H 2 O </li><li> Tolv fraktioner samlades från varje gel bana. Fraktionerna bestämdes med koncentrationer proteinband. Fraktionerna hackas till 1 mm bitar och uppsamlas i en 1,5 ml-rör. </li><li> Gelstycken var de-färgades med användning av 50% acetonitril och 0,1 M ammoniumbikarbonat i H 2 </sub&gt; O. Detta steg måste upprepas tills blåa färgen tas bort från gelbitar (cirka 3-4 gånger, 15 min varje gång). </li><li> De-färgade gelén stycken torkades med användning av 100% acetonitril (täcka gelstycken) under 15 min, supernatanten avlägsnades, och bitarna torkas med användning av en Speedvac. </li><li> Lös trypsin (Promega) vid 1:10 (trypsin: protein-förhållande) i samma volym (såsom poolade märkt prov) av 25 mM ammoniumbikarbonat. Till exempel behöver 600 | ig protein provet med en volym av 500 | il 60 ^ g trypsin upplöst i 500 | il av 25 mM ammoniumbikarbonat. </li><li> Tillsätt trypsin lösningen på gel bitar och inställd på is för att rehydrera. Om bitar inte täcks tillsätt 50 mM buffert ammoniumbikarbonat. Efter rehydrering, inkubera vid 37 ° C under 12-16 timmar. </li><li> Avlägsna vätskan proteinet utdrag ur inkuberade proverna. </li><li> Stoppa reaktionen och avlägsna eventuellt kvarvarande nedbrutet protein genom att täcka gelstycken med 5% myrsyra, 50% acetonitril .. Skaka gelstycken under 20 min vid rums temperature. Överför supernatanten till de extraherade rören proteinprov från 5,7. Upprepa extraktionen två gånger. Torka de extraherade peptider med användning av SpeedVac. </li></ol> 6. Provet Anrikning av cysTMT-märkta peptider <ol><li> Tillsätt en gradient av anti-TMT-harts till 0,5 ml rör för en 50% uppslamning. (Gradient bestämdes från bandet koncentration i fraktionering gelén. Om en fraktionsuppsamling består av en mörkt band, mer harts behövs. Fraktioner med svagare band kräver mindre harts som det finns mindre protein.) </li><li> Hartset tvättades sedan tre gånger med en kolonnvolym av 1 x Tris-buffrad saltlösning (TBS) (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,2) (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products). </li><li> Tillsätt 200 pl 1xTBS till varje prov. Proverna sattes därefter till anti-TMT-harts (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products) och omrördes vid rumstemperatur under 2 h följt av gungning över natten vid 4 ° C. </li><li> Lägg prov kolumn (TheRMO vetenskapliga Pierce Protein Research Products). </li><li> Tvätta varje kolumn tre gånger med 1 x 200 | il TBS. Detta följs sedan med tvättning tre gånger med 0,05% CHAPS (upplöst i 1 x TBS). </li><li> Kolonnen tvättas sedan tre gånger med 4 M urea i 1x TBS. Tvåhundra mikroliter av H 2 O används sedan för att tvätta kolonnen tre gånger. </li><li> Varje prov eluerades tre gånger med 200 | il 50% elueringsbuffert (50% acetonitril, 0,4% TFA). </li><li> Proverna torkades sedan i en vakuumkoncentrator. </li></ol> 7. Masspektrometrianalys <ol><li> Återsuspendera proverna i 12 | il 3% acetonitril med 0,1% myrsyra och injicera 5 pl direkt på en Eksigent NanoLC-1D högtrycksvätskekromatografi kolonn (AB SCIEX, USA). </li><li> Peptider kommer att separeras på en Proteopep II C18-kolonn 75 fim ID x 20 cm nya mål, USA) med användning av en 4-60% gradient (A: 3% acetonitril, 0,1% myrsyra; B: 97% acetonitril, 0,1% myrsyra syra)vid 3 | il / min under 60 min. </li><li> En Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL masspektrometer användes för att detektera peptider med en topp 2 x 3 experiment som består av ett steg MS följt av förvärvet av 3 MS / MS-spektra med högre energi C-fällan dissociation (HCD) fragmentering följt av 3 MS / MS med kollision dissociation (CID) för proteinidentifiering. Parametrar i detta läge var: Isolering bredd: 3,0 m / z; Kollisionsenergin: 50% (10% i två steg). Endast dubbelt-och trippelt laddade peptider ut för fragmentering. Dynamiska utslagning parametrar in på: Upprepa count = 1; Upprepa Längd = 60, uteslutande listan size = 500; uteslutningens varaktighet = 28. Målvärden är som följer: MS = 5 E 5, MS / MS (HCD) = 1 e 5. Jonöverföring tid var satt till 500 för FTMS och 300 för MS / MS (HCD). Två microscans krävdes för HCD spektra. </li></ol> 8. Databassökning och kvantifiering <ol><li> De förvärvade CID och HCD data var ettnalyzed med Thermo Scientific Proteome Discoverer mjukvara 1,2 (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products) genom en förgrenad arbetsflöde som genomförde en reporter Ion Quantizer (20 ppm massa tolerans fragmentjoner) att kvantifiera förhållandet. En separat segment bearbetas MS 2 spektra genom Spectrum Selector, Spectrum Normalizer och Spectrum noder Grouper. </li><li> Data har sedan sökte mot SEQUEST sökmotorn. En 20 ppm massan tolerans användes. Statiska ändringar sattes till cysTMT reagenset (304,18 Da) och dynamiska förändringar inkluderade fosforylering och metionin oxidation (15,99 Da). En anpassad databas för Solanum lycopersicum utgjordes med hjälp av RNA-data (med ca 350.000 poster från Harvard University) 13 användes i båda fallen. </li></ol> 9. Representativa resultat En representativ bild av en kontroll tomatplanta blad och en Pseudomonas inokulerat blad ärvisas i figur 1. En skillnad mellan behandlad kontroll och Pseudomonas behandlade blad observeras. Efter att bladen avlägsnas och färgades med DAB, de-färgning process möjliggör den histokemisk färgning för att visa tecken på ROS i bladvävnaden (figur 2). Figur 2A är representativ för en kontroll blad utan någon färgning. Figur 2B är representativ av ett blad som behandlats med Pseudomonas och positiv färgning för H 2 O 2-produktion. Ett exempel på Proteome Discover datautgången hos en regleras differentiellt redox-proteinet visas i Figur 3. Detta protein är en känd redox reglerad proteinet ferredoxin-en 14 och har visats spela en roll i försvaret mot Pseudomonas syringae pv tomat 15. Toppintensitet mellan kontroll och inokulerade prover användes för att erhålla relativ kvantifiering, som uppvisade signifikanta förändringar i ferredoxi-1 redox förordning (p &lt;0,05). Högintensiva toppar antyder att detta protein oxideras som svar på den patogen behandling. Figur 4 är ett exempel på Proteome Discover datautgången hos ett protein som har liknande redox reglering av ett protein mellan en kontroll och inokulerades prov. Topparna av liknande intensitet tyder på förekomst av disulfidbindningar som inte regleras av en förändring av behandlingen. Metoden kommer att revolutionera hur forskare upptäcker redox lyhörda cysteiner och disulfider 10. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> Figur 1. En representativ bild av inokulerad tomatblad med kontroll-lösning (A) och Pseudomonas (B). &lt;span class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> Figur 2. En representativ bild av DAB-färgning av inokulerad tomatblad med kontroll-lösning (A) och Pseudomonas (B). Bladen färgades med användning av 3&#39;-3 &#39;diaminobensidin. Klorofyll togs bort från blad genom kokning i 95% etanol. Mörk färgning indikerar närvaron av H2O 2. Bara lämnar ympas med bakteriekultur visade mörk färgning. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> Figur 3. Ett exempel på Proteome Discover datautgång av ferredoxin-1, differentiellt redox regleras proteinet 14. Peak intensiteten ovanför varje topp används för absolut kvantifiering. Peak intensitet mellan kontroll och inokulerade prov användsatt utföra relativ kvantifiering. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> Figur 4. Ett exempel på Proteome Discover datautgången hos ett protein som har liknande toppintensitet mellan en kontroll och inokulerades prov. Topparna av liknande intensitet tyder på förekomst av disulfidbindningar som inte regleras av en förändring av behandlingen.

<ol>
	<li>Almeida, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).</li><li>Preiter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+virulence+gene+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+strain+DC3000.">Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000.</a> J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).</li><li>Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+of+an+oxidative+burst+during+elicitation+of+cultured+plant+cells:+role+in+defense+and+signal+transduction.">Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction.</a> Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).</li><li>Orozco-Cardenas, M., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+is+generated+systemically+in+plant+leaves+by+wounding+and+systemin+via+the+octadecanoid+pathway.">Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6553-6557 (1999).</li><li>Tonks, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+redux:+revisiting+PTPs+and+the+control+of+cell+signaling.">Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling.</a> Cell. 121, 667-670 (2005).</li><li>Alvarez, S., Wilson, G. H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+disulfide-bonded+proteins+in+Arabidopsis.">Determination of in vivo disulfide-bonded proteins in Arabidopsis.</a> J. Chromatogr. B. 877, 101-104 (2009).</li><li>Apel, K., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species:+metabolism,+oxidative+stress,+and+signal+transduction.">Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 55, 373-399 (2004).</li><li>Dayon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+proteins+in+human+cerebrospinal+fluids+by+MS/MS+using+6-+plex+isobaric+tags.">Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6- plex isobaric tags.</a> Anal. Chem. 80, 2921-2931 (2008).</li><li>Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cysteine-reactive+tandem+mass+tag+reagent+for+subproteome+labeling,+enrichment+and+quantitation.">A novel cysteine-reactive tandem mass tag reagent for subproteome labeling, enrichment and quantitation.</a> , TP169 (2010).</li><li>Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+Arabidopsis+mutants:+diaminobenzidine+stain+for+hydrogen+peroxide.">Phenotypic analysis of Arabidopsis mutants: diaminobenzidine stain for hydrogen peroxide.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).</li><li>Sethuraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-Coded+affinity+tag+(ICAT)+approach+to+redox+proteomics:+identification+and+quantification+of+oxidant-sensitive+cysteine+thiols+in+complex+protein+mixtures.">Isotope-Coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: identification and quantification of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures.</a> J. Proteome Res. 3, 1228-1233 (2004).</li><li>Asso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+and+redox+characterization+of+ferredoxins+I+and+II+from+Desulfovibrio+vulgaris+Miyazaki.">EPR and redox characterization of ferredoxins I and II from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 198-204 (1995).</li><li>Huang, H. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+resistance+to+bacterial+pathogens+affected+by+the+amount+of+ferredoxin-I+proteins+in+plants.">Disease resistance to bacterial pathogens affected by the amount of ferredoxin-I proteins in plants.</a> Mol. Plant Pathol. 8, 129-137 (2007).</li><li>Hurkman, W., Tanaka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+plant+membrane+proteins+for+analysis+by+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis.</a> Plant Physiol. 81, 802-806 (1986).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Detta protokoll innehåller information om DAB färgning samt cysTMT märkta redox cystein kvantifiering. Dessa förfaranden är till nytta för att undersöka produktion av ROS samt effekt på protein reglering när Solanum lycopersicum ympas med Pseudomonas syringae. De metoder som presenteras i detta protokoll är ett sätt att undersöka ROS i hela bladprover på ett sätt som orsakar minsta skada på bladvävnad. Märkningen Förfarandet ger ett sätt att undersöka potentiellt redox regleras proteiner genom att använda en metod cystein märkning. Detta är fördelaktigt när man undersöker ett tidigt skede av stress. Metoder som isotop-kodad affinitetsmarkör (ICAT) och cysTMT kan användas för att avgöra eventuella redox reglerade proteiner i biologiska prover. ICAT gör märkning och jämförelse av två prover 12. Båda metoderna märka fria cysteiner och kan användas för protein quantification 10,12. Emellertid tillåter cysTMT metod för en minskning i experimentell variation liksom multiplexering 10. Antalet taggar tillgängliga möjligt för forskare att ta replikerar eller flera prover i sin experimentella design. Med fler prover ger möjlighet för ett större antal identifierade proteiner. En stor nackdel med den cysTMT teknik är att den äventyrar den totala kvaliteten av proteinidentifiering grund av den selektiva anrikningen stegen för cysTMT märkta peptider (6,5-6,6). Antalet peptider för proteinidentifiering beror till stor del på antalet cysteinrester i proteinsekvensen. Detta problem kan övervinnas genom att lämna en del av den tryptiska provet före anrikning för masspektrometri proteinidentifiering. På grund av karaktären av den experimentella utformningen såväl som märkning mekanism som den cysTMT metod utnyttjar vissa steg är kritiskt. Medan du utför protein precisionpitation och pellets tvättar (3,9) är det viktigt att hålla prover kylas på is för att minska proteinnedbrytning. Under cysTMT märkning är avlägsnande av reduktionsmedel (4,6) viktig, eftersom prover kan genomgå omvänd märkning. Omvänd märkning är möjlig om reduktionsmedel kvar i provet. Om proverna reduceras efter märkning, kan cysTMT taggen avlägsnas. När väl etiketten sätts till proverna, måste pH-värdet kontrolleras (4,7) för att få optimal märkning effektivitet. Dessutom är dataanalys beror på vad som krävs av forskaren och det slutliga målet att använda protokollet. Det är också beroende av programvara som används som varje program har olika algoritmer. Detta experiment använder patogen som elicitor för ökad produktion av reaktiva oxidativa arter i tomat, men kan andra redox reglerade svar mätas i enlighet därmed. Denna experimentella designen kan anpassas till andra anläggningar och system djur. </p&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> MetroMix 500 </td><td> BWI Företag </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-diaminobensidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep Sekventiell Extraktion kit Reagens 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X-proteinanalysen </td><td> Geno teknik </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT reagens </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 90.071 </td></tr><tr><td> Laemmli provbuffert </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Bio-Safe Comassie (G-250-färg) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3KD kolonn </td><td> Millipore </td><td> 42.403 </td></tr><tr><td> Immobiliserade anti-TMT-harts </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 90.076 </td></tr><tr><td> Centrifug kolonn </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 89.896 </td></tr><tr><td> Proteopep II C18-kolonn </td><td> Nya mål </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90.389 </td></tr><tr><td> LTQ-Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Proteomanalys Discoverer 1,2 mjukvara </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge centrifugrör </td><td> Thermo Scientific Nalgene Företag </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Mikrocentrifugrör (2 ml) </td><td> USA Scientific </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% mini-Protean TGX Precast Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Överst på Form &gt; Bio-Safe Coomassie StainBottom Form </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT anrikning kit </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Research Products </td><td> 90.077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

Pseudomonas syringae pv. Planta DC3000 inte bara orsakar bakteriell fläck sjukdom i Solanum lycopersicum utan även på Brassica-arter, såväl som på Arabidopsis thaliana, en genetiskt foglig värdväxt 1,2. Ackumuleringen av reaktiva syrespecies (ROS) i kotyledoner inokulerade med DC3000 indikerar en roll för ROS vid modulering nekrotisk celldöd under bakteriell sjukdom fläck av tomat 3. Väteperoxid, en komponent av ROS, framställs efter inokulering av tomatplantor med Pseudomonas 3. Väteperoxid kan detekteras med användning av en histokemisk färgning 3&#39;-3 &#39;diaminobensidin (DAB) 4. DAB-färgning reagerar med väteperoxid för att producera en brun fläck på bladvävnad 4. ROS har en reglerande roll av den cellulära redox miljön, vilket kan ändra redox status för vissa proteiner 5. Cystein är en viktig aminosyra känslig förredox förändringar. Under mild oxidation, tjänar reversibel oxidation av cystein sulfhydrylgrupper såsom redox sensorer och omformare signal som reglerar ett flertal fysiologiska processer 6,7. Tandemmasspektrometri tagg (TMT) reagens möjliggör samtidig identifiering och multiplexeras kvantifiering av proteiner i olika prov med användning av tandemmasspektrometri 8,9. De cystein-reaktiva TMT (cysTMT) reagens möjliggör selektiv märkning och relativ kvantifiering av cystein-innehållande peptiderna från upp till sex biologiska prover. Varje isobarisk cysTMT tagg har samma nominella modermassan och är sammansatt av en sulfhydryl-reaktiv grupp, en MS-neutralt spacerarm och en MS / MS-reportern 10. Efter märkning proverna föremål för proteasklyvning. De cystein-märkta peptider anrikades med användning av en harts innehållande anti-TMT-antikropp. Under MS / MS-analys, en serie reporter joner (dvs 126-131 Da) dyker upp i den låga massan regionen med information om relativ kvantifiering.Arbetsflödet är effektiv för att minska urvalet komplexiteten, förbättra dynamiskt omfång och studera cystein ändringar. Här presenterar vi redox proteomic analys av Pst behandlade DC3000 tomat (Rio Grande) lämnar hjälp cysTMT teknik. Detta högeffektiv metod har potentialen att användas för att studera andra redox-reglerade fysiologiska processer.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Reaktiva syrespecies-nivån är förhöjd när celler möter stressförhållanden. Här visar vi som exempel 3&#39;-3 &#39;diaminobensidin färgning liksom cysTMT märkning och masspektrometri för att profilera redox proteomanalys i<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Behandlades tomatblad.

Profilering Tiol Redox Proteome Användning Isotope spektrometri Taggning Mäss

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

En kvantitativ bedömning av jästen Lipidome med elektrospray Spektrometri jonisation

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Analysera stora proteinkomplex från struktur-masspektrometri

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

Oligo Mass profilering (OLIMP) av Extracellulär Polysackarider

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Direkt analys av enskilda celler med masspektrometri vid atmosfärstryck

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Profilering av metyltransferaser och andra S-Adenosyl- L-Homocystein-bindande proteiner av Capture Compound masspektrometri (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kvantifiering av proteiner med Peptide Immunoaffinity Anrikning kombination med masspektrometri

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Vald Reaction Monitoring masspektrometri för Absolute protein kvantifiering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Identifiering av MyoD Interactome Använda Tandem Affinity Purification Kopplad till masspektrometri

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellulär redoxprofilering med hög innehållsmikroskopi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...