Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

يتم اعتماد الكتاب من النجم * من سنغافورة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم اعتماد المنح الدراسية من قبل MJF النجوم A * الوطنية للعلوم، وهي لوريال للنساء في ميدان العلم الوطني وزمالة لي كوان يو زمالة ما بعد الدكتوراه. ويدعم ترميز YR من منح المعاهد الوطنية للصحة (R01-01 HG004456 وR01 HG003521-01). الكتاب نعترف أيضا فريق بالفيديو للإنتاج بكسل 8، سنغافورة، ولا سيما ايسي كلفن، والسيد تشانغ شيانغ كاي والسيد جان شيرون لتصوير المشاهد، السيدة ستي الرحيم لتحرير الفيديو والسيدة ميشيل تيو لل الصوت عبر.

<ol>
	<li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB1+packages+densely+looped,+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes.">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li><li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+replication+and+transcription.">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li><li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states.">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li><li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei.">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li><li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing.">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22 (2010).</li><li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation.">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li><li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis.">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12 (2007).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li><li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+at+a+distance:+DNA-looping+and+initiation+of+transcription.">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li><li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شيا-PET هو طريقة تم تطويرها لتحديد التفاعلات طويلة المدى في تنظيم النسخ. واحدة من العوامل الحاسمة التي تحدد نوعية مكتبة شيا-PET هي نوعية المواد رقاقة. البروتوكول هو موضح في الفيديو يتضمن استخدام السلع والخدمات البيئية والفورمالديهايد لعبور الارتباط الخلايا. فإن استخدام الفورمالدهايد جنبا إلى جنب مع كاشف عبر ربط 2 تحمل الذراع يعد التبادل تساعد في الربط من البروتينات التي لا يمكن أن تكون ملزمة الفورمالديهايد وحدها 3،11،15. لقد وضعنا المكتبات مع هذه الطريقة التي أثبتت مواقع الربط قوية وطويلة المدى التفاعلات 9. ومع ذلك، قد عبر ربط وينبغي أن يكون الأمثل ظروف رقاقة لكل عامل في المصالح، وأنه من المهم عدم الإفراط تشعبي كما الكثير عبر ربط سيؤدي إلى صعوبات في تجزئة من قبل صوتنة، ويؤدي ربما في التفاعلات ونين زائفة . لونين التفاعلاتوينبغي التحقق من صحة التي حددتها شيا-PET بطريقة مختلفة، مثل التهجين في الموقع مضان 4. نوصي ما لا يقل عن 100 نانوغرام من المواد لونين. ولئن كنا قد شيدت المكتبات نوعية جيدة من 50 نانوغرام من المواد لونين، لاحظنا أن كميات كبيرة من المواد بدءا يسمح بناء شيا-PET المكتبات مع دورات PCR أقل من 16، وبالتالي تقليل amplicons والتكرار من كل مكتبة. هذا أقل التكرار يرتبط به أعلى فريدة من نوعها، وكذلك تعيين نسبة عالية من البيانات القابلة للاستخدام، وبالتالي تمكين تفاعل أكثر شمولا لونين مع عدد أقل من الخريطة حارات التسلسل. ينبغي أن الحجم النهائي معبأة من الخرز في كل أنبوب يكون 50 ميكرولتر ميكرولتر 100 لوالخرز المغناطيسي وsepharose و على التوالي. وإذا كان حجم حبة معبأة هو أقل من المعلن، وتحقيق الحد الأدنى لحجم محملة مسبقا وبالمثل مسح فارغة الخرز المغناطيسي أو sepharose و لتقليل الخسائر في DNA الحاملة للحبةق في الخطوات اللاحقة. وينبغي أن تستخدم لمرة واعادوا نصائح او نصائح واسعة الأساسية لpipetting الخرز sepharose و. وقد أدرجت التعديلات التالية بعد بروتوكول شيا-PET المنشورة سابقا 5. أولا، تم استخدام الخرز المغناطيسي G لتقليل الخسائر خلال عينة يغسل. وبالإضافة إلى ذلك، حددنا نطاقات غير محددة مع أحجام تقريبية من 100 شركة بريتيش بتروليوم BP و138 إلى تكون amplicons الذاتي ligated linkers نصف أو / والمحولات. وبالتالي، خفضنا تركيز المعقدة البيروكسيديز linkers نصف و 454 محولات GS20 للحد من نطاقات غير محددة خلال التضخيم PCR. تم تخفيض حجم ربط القرب من 50 مل إلى 10 مل لتقليل الخسائر خلال عينة الخطوات اللاحقة تنقية وحفظ أيضا على تكاليف كاشف. ونحن أيضا زيادة فترة حضانة لشل شيا-PET DNA لالتقاط حبات لضمان القصوى لشيا-PET DNA على الخرز streptavidin. خلال ربط القرب الخطوة، عمليات ربط خيالية ثار لا تمثل الحقيقية في التفاعلات المجراة لونين يتم إنشاؤها حتما بطريقة غير محددة وبشكل عشوائي. وبالتالي، لتقييم جودة البيانات من أي تجربة شيا-PET، ويقدر معدل الخيمرية من استخدام اثنين من مختلف linkers نصف مع محددة TAAG الباركود النوكليوتيدات وATGT 5. بعد التسلسل الإنتاجية العالية، ويتم تحليل متواليات شيا لأول مرة-PET لتكوين رابط الباركود وتسلسل مشتقة من منتجات محددة ومنتجات ربط ربط غير محددة يمكن تمييزها 8. النسبة المئوية للتعرف الوهم (أي heterodimers linkers AB) الموجودة في منزلنا في MCF-7 RNA البلمرة II-PET المكتبات شيا هو أقل من 15٪. وتصنف فيما بعد شيا-PET متواليات إلى فئتين، هما الذاتي ربط الحيوانات الأليفة والحيوانات الأليفة ربط بين. ويتم الحصول على الحيوانات الأليفة ربط الذاتي من التعميم ربط الذاتي من لونين شظايا في حين يتم اشتقاق ربط بين الحيوانات الأليفة من أناnter-ربط بين اثنين من شظايا الحمض النووي مختلفة. هذا الأخير هو ثم تقسيمها إلى ثلاث فئات مختلفة استنادا إلى المسافة الجينية من كل علامة على نفس الصبغي (داخل الصبغي ربط بين الحيوانات الأليفة) أو التي يتم تعيينها إلى كل من به صبغيين مختلفة (interchromosomal ربط بين الحيوانات الأليفة). قمنا بتطوير برنامج أداة شيا-PET حزمة لفرز الفئات المختلفة 8. وسوف يستند هذا على شظايا الحمض النووي الموجودة في المكتبة. عموما، سوف شظايا أصغر رقاقة تعطي دقة أعلى وقطع لهذه المكتبات البلمرة RNA-PET شيا II حوالي 4 كيلو بايت. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تمييز الحقيقي من التفاعلات لونين الضجيج العشوائي عن طريق حساب عدد من الحيوانات الأليفة ربط بين كتلة في التفاعل، وبعبارة أخرى، قال مجموعة من العد PET عالية لديها أعلى احتمال كونه تفاعل حقيقي لونين 8 . لتصفية ايجابيات كاذبة لدينايرتفع من المراسي عالي التخصيب التي يمكن أن تشكل ربط بين الحيوانات الأليفة عن طريق الصدفة العشوائية، كما تم وضع إطار التحليل الإحصائي وضعت لتشكل تشكيل عشوائية من الحيوانات الأليفة أي ربط بين بين اثنين من المراسي 8. في الختام، هذه التقنية تسمح شيا-PET رسم خرائط شبكات التفاعل لونين على نطاق عالمي. تنفيذ المعالج في شيا-PET يسمح في الحد من التعقيد ومكتبة ضجيج في الخلفية. وبالإضافة إلى ذلك، يضيف رقاقة خصوصية لونين التفاعلات، وتمكن من دراسة التفاعلات لونين المحددة المرتبطة عوامل النسخ خاص 5.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 4-20٪ التدرج TBE هلام </td><td> إينفيتروجن </td><td> EC6225BOX </td><td> الخطوة B، 6.3 </td></tr><tr><td> 5 × يغاز DNA T4 العازلة مع PEG </td><td> إينفيتروجن </td><td> 46300018 </td><td> B الخطوة، 2.2 </td></tr><tr><td> 6٪ TBE هلام </td><td> إينفيتروجن </td><td> EC6263BOX </td><td> الخطوة B، 6.8 </td></tr><tr><td> اجيلنت DNA 100 الفحص </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> B الخطوة، 7.1 </td></tr><tr><td> اجيلنت DNA حساسية عالية الفحص </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> اجيلنت Bioanalyzer 2100 </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> أجهزة الطرد المركزي أنابيب مرشحات (SPIN-X) </td><td> كورنينج &lt;/ TD&gt; <td> CLS8160 </td><td> الخطوة B، 3.7 و 6.9 </td></tr><tr><td> الظلام قارئ Transilluminator </td><td> كلير بحوث الكيميائية </td><td> DR46B </td><td> الخطوة B، 6.8 </td></tr><tr><td> Sonifier الرقمية المحمولة ديسروبتر </td><td> برانسون </td><td> 450D-0101063591 </td><td> خطوة، 4.3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 المغناطيس (المغناطيسي المكثف الجسيمات) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 123-21D </td><td> خطوة خطوة 7.5.1، B، لجميع الخرز المغناطيسي الغسيل الخطوات </td></tr><tr><td> DynaMag-15 المغناطيس (المغناطيسي المكثف الجسيمات) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 123.01D </td><td> الخطوة A، 5 و 6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (المغناطيسي المكثف الجسيمات) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 49-2025 </td><td> الخطوة B، 6.5 </td></tr><tr><td> البلمرة DNA القولونية القولونية I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> الخطوة B، 5.6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </TD&gt; <td> خطوة خطوة 7.5.1، B، 4.3 و 6.5 </td></tr><tr><td> البورشيد الجيل الكتلة CBOT النظام </td><td> البورشيد </td><td> SY-301-2002 </td><td> B الخطوة، 7.4 </td></tr><tr><td> محلل البورشيد الجينوم منظمة شات </td><td> البورشيد </td><td> SY-301-1301 </td><td> B الخطوة، 7.5 </td></tr><tr><td> البورشيد PE الاشعال </td><td> البورشيد </td><td> PE-102-1004 </td><td> B الخطوة، 5.4 (إذا لزم الأمر) </td></tr><tr><td> Intelli-خلاط </td><td> Palico التكنولوجيا الحيوية </td><td> RM-2L </td><td> الخطوة B، أي مع دوران حضانات </td></tr><tr><td> LightCycler 480 نظام PCR في الوقت الحقيقي </td><td> روش </td><td> 04 640 268 001 </td><td> الخطوة A، B الخطوة 7.5.3، 7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR الخضراء I MasterMix </td><td> روش </td><td> 03 752 186 001 </td><td> B الخطوة، 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 Streptavidin Dynabeads </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11206D </td><td> الخطوة B، 5.2 </td></tr> &lt;TR&gt; <td> المغناطيسي (Dynabeads) بروتين G </td><td> إينفيتروجن </td><td> 100.03D </td><td> الخطوة A، و5.1.1 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract عالية الكثافة (2ml) </td><td> QIAGEN </td><td> 129056 </td><td> الخطوة 7.5.1، </td></tr><tr><td> MaXtract عالية الكثافة (50ML) </td><td> QIAGEN </td><td> 129073 </td><td> B الخطوة، 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز ONE ريبونوكلياز </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> B الخطوة، 4.8 </td></tr><tr><td> RNA البلمرة II (8WG16) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة </td><td> كوفانس </td><td> MMS-126R </td><td> الخطوة A، 5.2.4 </td></tr><tr><td> أنابيب الطرد المركزي البلوط ريدج (البولي بروبلين) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> خطوة، 3.1 </td></tr><tr><td> أنابيب الطرد المركزي البلوط ريدج (تفلون FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> B الخطوة، 4.3 </td></tr><tr><td> Phusأيون عالية الإخلاص ماجستير ميكس </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> الخطوة B، 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (كوانت-IT) dsDNA الكاشف </td><td> إينفيتروجن </td><td> P11495 </td><td> الخطوة A، 7.5.2 </td></tr><tr><td> البوليسترين اختبار القاع جولة تيوب </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 352057 </td><td> خطوة، 4.1 </td></tr><tr><td> أقراص البروتيني كوكتيل المانع (كامل، EDTA خالية) </td><td> روش </td><td> 11873580001 </td><td> خطوة، 1.6 وما بعده </td></tr><tr><td> بروتين K الحل (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> الخطوة A، 4.4، 7.5.1 B الخطوة، 4.1 </td></tr><tr><td> T4 DNA يغاز </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> B الخطوة، 2.2، 3.9 و 5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA يغاز العازلة (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> B الخطوة، 3.3 و 3.9 </td></tr><tr><td> T4 DNA البلمرة </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>B الخطوة، 1.2 </td></tr><tr><td> T4 كيناز عديد النوكليوتيد DNA </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> الخطوة B و 3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS كيت V5-GA </td><td> البورشيد </td><td> FC-104-5001 </td><td> الحكام لنظام الجينوم البورشيد منظمة شات محلل </td></tr><tr><td> TruSeq PE-V2 الكتلة كيت CBOT-GA </td><td> البورشيد </td><td> PE-300-2001 </td><td> أن يكون استخدام مع الكتلة البورشيد CBOT نظام توليد </td></tr><tr><td> SYBR الخضراء I </td><td> إينفيتروجن </td><td> S-7585 </td><td> B الخطوة، 6.3 و 6.8 </td></tr><tr><td> إكس سيل SureLock النظام الكهربائي ميني خلية </td><td> إينفيتروجن </td><td> EI0001 </td><td> B الخطوة، 6.3 و 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td colspan="2"> تسلسل </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td rowspan="2"> المعقدة البيروكسيديز نصف linkers A (200ng/μl) </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق HPLC تنقية الداخلية البيوتين DT (9) </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق HPLC تنقية </td></tr><tr><td rowspan="2"> المعقدة البيروكسيديز نصف linkers B (200ng/μl) </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق HPLC تنقية الداخلية البيوتين DT (9) </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق HPLC تنقية </td></tr><tr><td rowspan="2"> غير المعقدة البيروكسيديز نصف linkers (200ng/μl) </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 محول A (200ng/μl) </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;CCA TCT CAT GTG CCC TGC TCC CATCTG TTC CTC CCT CCC TGT AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG GAT CAG GGA TGA GG 3 &#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 محول B (200ng/μl) </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;AGA CTG CAC GCA ACA GGG GAT CAA AGG GGC ACA CAG GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5 &#39;CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA GTT TCC CCT GCG TGT CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td rowspan="2"> البورشيد-NN محولات </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC ACG TAC ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق HPLC تنقية انظر الخطوة B و 5.4 </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5 &#39;فوس - GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> فسفرته 250 nmole نطاق HPLC تنقية نهاية 5 &#39;انظر الخطوة B و 5.4 </td></tr><tr><td> البورشيد 1-454 (إلى الأمام) التمهيدي (10 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC ACC GAG ATC TAC GTG CTA TCC CCT TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> البورشيد 2-454 (العكسية) التمهيدي (10 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> qPCR التمهيدي 1.1 (10 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GAG ACC ACC GCG AT 3&#39; </td><td> 10nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> qPCR التمهيدي 2.1 (10 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> البورشيد التمهيدي التسلسل 3-454 (100 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG TTC CTC CCT CCC TGT AG 3 &#39; </td><td> 100nmole نطاق HPLC تنقية </td></tr><tr><td> البورشيد التمهيدي التسلسل 4-454 (100 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT TGC CTA GTT TCC CCT GCG TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole النطاقHPLC تنقية </td></tr></tbody></table> وصف oligos ترتيب جدول oligos والمحولات. من تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) وإعداد linkers ومحولات بنفس الطريقة كما في السابق 10. قد تكون مستعدة نصف linkers ومحولات مسبقا وتخزينها لعدة أشهر في -20 ° C.

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

ويتم تنظيم الجينوم في هياكل ثلاثية الأبعاد، واعتماد العليا التشكل داخل المساحات ميكرون الحجم النووية 7، 2، 12. أبنية هذه ليست عشوائية وتنطوي على التفاعل بين الجينات والمروجين العناصر التنظيمية 13. الربط من عوامل النسخ متواليات التنظيمية ليجلب محددة شبكة من تنظيم النسخ والتنسيق 1، 14. وقد وضعت لونين تحليل التفاعل عن طريق ترتيب العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لتحديد هذه الهياكل العليا لونين 5،6. يتم إصلاح الخلايا ويتم التقاطها بواسطة التفاعل المكاني التساهمية DNA البروتين الروابط المتبادلة. للحد من الضوضاء غير محددة والحد من التعقيد، وكذلك لزيادة خصوصية تحليل التفاعل لونين، لونين مناعي يستخدم (رقاقة) ضد العوامل المحددة لتخصيب البروتين شظايا لونين من الفائدة قبل ربط القرب. ربط تنطوي نصف linkers تشكل في وقت لاحق الروابط التساهمية بين أزواج من شظايا الحمض النووي المربوطة معا ضمن مجمعات لونين الفردية. تقييد انزيم مواقع MmeI المرافقة في linkers نصف تسمح استخراج المقترنة يبني مجتمع طلال أبوغزاله للرابط، علامة النهاية (الحيوانات الأليفة) على الهضم MmeI. كما هي المعقدة البيروكسيديز وlinkers نصف، وتنقية هذه التركيبات PET باستخدام streptavidin المغناطيسي الخرز. وligated الحيوانات الأليفة تنقيته مع محولات الجيل القادم التسلسل وفهرس للشظايا التفاعل يتم إنشاؤها عن طريق الجيل المقبل من التعاقب مثل الجينوم محلل البورشيد. ثم يتم تنفيذ رسم الخرائط وتحليل المعلومات البيولوجية للتعرف على رقاقة التخصيب ملزمة المواقع ورقاقة التخصيب التفاعلات ونين 8. لدينا انتاج شريط فيديو لإثبات الجوانب الحاسمة للبروتوكول شيا-PET، وخاصة إعداد شريحة ونوعية المعالج تلعب دورا رئيسيا في نتائج مكتبة شيا-PET. كما البروتوكولات هيطويلة جدا، وتظهر فقط الخطوات الحاسمة في الفيديو.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

الكروماتين تحليل التفاعل عن طريق ترتيب العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) هو وسيلة ل<em&gt; من جديد</em&gt; الكشف عن التفاعلات لونين، لفهم أفضل للتحكم النسخي.

الكروماتين تحليل التفاعل مع تسلسل العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لرسم خرائط التفاعلات الكروماتين وفهم تنظيم النسخ

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

والفحص الكروماتين لأنسجة المخ الإنسان

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

قراءة واحدة المقترنة مكتبات نهاية البورشيد مرنا ، في الفترة من 10 نانوجرام تسلسل الحمض النووي الريبي مجموع

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

لونين مناعي (رقاقة) باستخدام ذبابة الفاكهة الأنسجة

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

جيل وتنقية الإنسان INO80 ونين إعادة عرض مجمعات وSubcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

فحوصات البيوكيميائية لتحليل أنشطة ATP التي تعتمد على لونين إعادة عرض الانزيمات

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...