Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

由A *新加坡星撰文支持。此外，支持的A * STAR国家科学奖学金，妇女在国家科学院士和李光耀博士后奖学金1欧莱雅的MJF。里亚尔支持由NIH的ENCODE的补助金（以R01 HG004456-01和以R01 HG003521-01）。作者也承认，录像的8个像素的制作，特别是开尔文先生一生之水，张先生启翔先生和宣威甘，新加坡队，为拍摄场景，视频编辑和米歇尔张志贤女士女士西蒂·拉希姆画外音。

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没有利益冲突的声明。

CHIA-PET是开发，以确定转录调控中的长程相互作用的方法。确定的嘉PET库质量的关键因素之一是芯片材料的质量。 在视频显示的协议，采用交叉连接细胞（EGS）和甲醛的使用。交联的第二个轴承较长的间隔臂的试剂结合使用甲醛，可能有助于蛋白质不能甲醛的约束，仅3,11,15约束力。我们已经构建库，此方法已显示出强大的结合位点和长程相互作用9。然而，交联和芯片的条件应为每个感兴趣的因素优化，重要的是不要过度的交联，作为交联太多会导致碎片中的困难，通过超声，并可能导致虚假的染色质相互作用。染色质相互作用应当验证由不同的方法，如荧光原位杂交4，由嘉义PET标识。 我们建议至少100吴质材料。虽然我们已经构建从50吴质材料质量好的库，我们已经指出，允许起始原料的大量嘉PET少于16个PCR循环，从而最大限度地减少每个库的扩增和冗余库建设。这种较低的冗余与较高的独特的映射标签和高比例的可用数据，从而使染色体的测序较少的车道更全面的互动地图。最终每管装珠量应该是50μL和100μL的磁场和琼脂糖珠分别。如果包装珠体积小于说，同样预先清除空白磁或琼脂糖珠的最小包装量，以尽量减少损失的DNA-轴承珠S在随后的步骤。个子矮的小技巧大核心提示应使用移液琼脂糖珠。 继先前公布的CHIA-PET的协议被纳入下列修改。首先，磁性Ğ珠被用来在清洗，以尽量减少样品的损失。此外，我们发现非特异性条带，大小约100个​​基点和138基点，是自我结扎半连接器或/和适配器的扩增。因此，我们减少生物素的一半，连接器和454 GS20适配器，以尽量减少非特异性条带，PCR扩增过程中的浓度。接近结扎量减少，从50毫升至10毫升，在随后的纯化步骤，以尽量减少样品的损失，也节省试剂成本。我们还增加了孵化时间固定嘉PET DNA珠，链霉亲和素珠CHIA-PET的DNA，以确保最大的捕获。 在接近结扎一步，THA嵌合结扎t没有代表在体内染色质相互作用的真实，都不可避免地在一个非特定的和随机的方式产生。因此，任何CHIA-PET的实验数据的质量评估，嵌合率估计从两个不同的特定核苷酸条码TAAG和ATGT的5半交联剂的使用。 CHIA-PET的序列高通量测序后，首先来自特定结扎产品和非特异性结扎产品的链接条码组成和序列分析可以区分8。被称为嵌合体的比例（即异AB连接器）呈现在我们的内部MCF-7 RNA聚合酶II CHIA-PET的图书馆是低于15％。 嘉PET序列，其后分为两大类，即自我结扎宠物间结扎宠物。自我结扎宠物获得自我函证结扎染色质片段，而从我而得间结扎宠物NTER结扎两种不同的DNA片段。后者再细分为三个不同的类别，基于相同的染色体（染色体内间结扎宠物）或标签都被映射到两个不同的染色体（interchromosomal间结扎宠物）的基因组上的每个标签距离。我们已经开发了1 CHIA-PET的工具软件包，理清不同类别8。这将根据库中的DNA片段。一般来说，小的芯片碎片会给一个更高的分辨率，并切断这些RNA聚合酶II嘉PET库大约是4 KB。 此外，真正的染色质相互作用可以从随机噪声区分计数间结扎宠物互动集群的数量，换句话说，高PET计数集群据说有更高的概率是一个真正的染色质相互作用8 。 来过滤误报1上升，从高浓缩铀的锚定能形成随机机会间结扎宠物，统计分析框架也已制定占到任何两锚8间结扎宠物随机形成。 总之，CHIA-PET的技术允许映射在全球范围内的染色质相互作用网络。嘉义PET芯片的实施，使图书馆的复杂性和背景噪音减少。此外，芯片增加特异性染色质相互作用，使特定的染色质相互作用与特定的转录因子5的考试。

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td> 4-20％梯度TBE凝胶</td><td> Invitrogen公司</td><td> EC6225BOX </td><td>步骤b，6.3 </td></tr><tr><td> 5×T4 DNA与PEG连接酶缓冲液</td><td> Invitrogen公司</td><td> 46300018 </td><td>步骤B，2.2 </td></tr><tr><td> 6％TBE凝胶</td><td> Invitrogen公司</td><td> EC6263BOX </td><td>步骤b，6.8 </td></tr><tr><td>安捷伦DNA 100含量</td><td>安捷伦科技公司</td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3">步骤B，7.1 </td></tr><tr><td>安捷伦高灵敏度DNA检测</td><td>安捷伦科技公司</td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td>安捷伦生物分析仪2100 </td><td>安捷伦科技公司</td><td> G2940CA </td></tr><tr><td>离心管过滤器（自旋X） </td><td>康宁&lt;/ TD&gt; <td> CLS8160 </td><td>步骤B，3.7和6.9 </td></tr><tr><td>黑暗读者透射</td><td>克莱尔化学研究</td><td> DR46B </td><td>步骤b，6.8 </td></tr><tr><td>数字Sonifier细胞破碎</td><td>布兰森</td><td> 450D-0101063591 </td><td>步骤一，4.3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2磁体（磁粉浓缩） </td><td> Invitrogen公司</td><td> 123-21D </td><td>步骤，7.5.1步骤B，磁珠洗涤步骤</td></tr><tr><td> DynaMag-15磁体（磁粉浓缩） </td><td> Invitrogen公司</td><td> 123.01D </td><td>步骤一，5和6 </td></tr><tr><td> DynaMag聚合酶链反应（磁粉选矿厂） </td><td> Invitrogen公司</td><td> 49-2025 </td><td>步骤b，6.5 </td></tr><tr><td> 大肠杆菌 DNA聚合酶I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td>步骤b，5.6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion公司</td><td> AM9516 </TD&gt; <td>步骤一，7.5.1步骤B，4.3和6.5 </td></tr><tr><td> Illumina的CBOT集群发电系统</td><td> Illumina公司</td><td> SY-301-2002 </td><td>步骤B，7.4 </td></tr><tr><td> Illumina的基因组分析仪IIx能</td><td> Illumina公司</td><td> SY-301-1301 </td><td>步骤B，7.5 </td></tr><tr><td> Illumina的体育引子</td><td> Illumina公司</td><td> PE-102-1004 </td><td>步骤B，5.4（如有必要） </td></tr><tr><td>智能混合机</td><td>百利高技</td><td> RM-2L </td><td>步骤b，任何孵化与旋转</td></tr><tr><td>的LightCycler 480实时PCR系统</td><td>罗氏公司</td><td> 04 640 268 001 </td><td>步骤一，7.5.3步骤B，7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR Green I的MasterMix </td><td>罗氏公司</td><td> 03 752 186 001 </td><td>步骤B，7.5.3 </td></tr><tr><td>的M-280链霉亲和素磁珠</td><td> Invitrogen公司</td><td> 11206D </td><td>步骤b，5.2 </td></tr> &lt;TR&gt; <td>磁（磁珠）G蛋白</td><td> Invitrogen公司</td><td> 100.03D </td><td>步骤一，5.1.1和5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract高密度（2毫升） </td><td> Qiagen公司</td><td> 129056 </td><td>步骤一，7.5.1 </td></tr><tr><td> MaXtract高密度（50毫升） </td><td> Qiagen公司</td><td> 129073 </td><td>步骤B，4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td>核糖核酸酶一核糖核酸</td><td> Promega公司</td><td> M426C </td><td>步骤B，4.8 </td></tr><tr><td> RNA聚合酶II（8WG16）单克隆抗体</td><td> Covance公司</td><td> MMS-126R </td><td>步骤一，5.2.4 </td></tr><tr><td>橡树岭离心管（聚丙烯） </td><td> NALGENE </td><td> 3119-0050 </td><td>步骤一，3.1 </td></tr><tr><td>橡树岭离心管（铁氟龙FEP） </td><td> NALGENE </td><td> 3114-0050 </td><td>步骤B，4.3 </td></tr><tr><td> phus离子高保真预混</td><td> finnzymes </td><td>架F-531 </td><td>步骤b，6 </td></tr><tr><td> picogreen（QUANT-IT）双链DNA试剂</td><td> Invitrogen公司</td><td> P11495 </td><td>步骤一，7.5.2 </td></tr><tr><td>聚苯乙烯圆底试管</td><td> BD公司</td><td> 352057 </td><td>步骤一，4.1 </td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片（完整，EDTA免费） </td><td>罗氏公司</td><td> 11873580001 </td><td>步骤一，1.6起</td></tr><tr><td>蛋白酶K溶液（20mg/mL时） </td><td> Fermentas公司</td><td> E00491 </td><td>步骤A，4.4，7.5.1 步骤B，4.1 </td></tr><tr><td> T4 DNA连接酶</td><td> Fermentas公司</td><td> EL0013 </td><td>步骤B，2.2，3.9和5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA连接酶缓冲液（NEB） </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td>步骤B，3.3和3.9 </td></tr><tr><td> T4 DNA聚合酶</td><td> Promega公司</td><td> M4215 </td><td>步骤B，1.2 </td></tr><tr><td> T4 DNA多聚核苷酸激酶</td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td>步骤b，3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS的工具包V5-GA </td><td> Illumina公司</td><td> FC-104-5001 </td><td>高中会考的Illumina的Genome Analyzer的IIx能系统</td></tr><tr><td> TruSeq体育群集工具包V2-CBOT-GA </td><td> Illumina公司</td><td> PE-300-2001 </td><td>利用Illumina的CBOT集群发电系统</td></tr><tr><td> SYBR Green I的</td><td> Invitrogen公司</td><td>的S-7585 </td><td>步骤B，6.3和6.8 </td></tr><tr><td> Xcell的的SureLock迷你细胞电泳系统</td><td> Invitrogen公司</td><td> EI0001 </td><td>步骤B，6.3和6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 名称 </td><td colspan="2"> 序列 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td rowspan="2">生物素的一半，连接器（200ng/μl） </td><td>顶部</td><td> 5&#39;GG化学计算海巡署/ iBiodT / ATC TTA台泥的AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole的规模高效液相色谱纯化内部生物素DT（9） </td></tr><tr><td>博特</td><td> 5&#39;滋养细胞的TAA GGA GAT的空中交通管制气相色谱3&#39; </td><td> 250 nmole的规模高效液相色谱纯化</td></tr><tr><td rowspan="2">生物素的一半，连接器（200ng/μl） </td><td>顶部</td><td> 5&#39;GGC政府总部大楼的GA / iBiodT / ATA CAT台泥的AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole的规模高效液相色谱纯化内部生物素DT（9） </td></tr><tr><td>博特</td><td>糖耐量GGA ATG的5&#39;达航管气相色谱3&#39; </td><td> 250 nmole的规模高效液相色谱纯化</td></tr><tr><td rowspan="2">非生物素半交联剂（200ng/μl） </td><td>顶部</td><td> 5&#39;GGC GAT的政府总部大楼航管GGA台泥的AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole的规模PCR级</td></tr><tr><td>博特</td><td>糖耐量GGA TCC的5&#39;GAT的空中交通管制的GC 3&#39; </td><td> 250 nmole的规模PCR级</td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20适配器一个（200ng/μl） </td><td>顶部</td><td>文建大老山隧道的CAT 5&#39;CCC认证炉TGC GTG台泥的CATCTG的交委会建CCC认证TGT的反恐活动星系核的N 3“ </td><td> 250 nmole的规模PCR级</td></tr><tr><td>博特</td><td> AGA公司5&#39;CTG造影GGA GGG的AAC AGA公司TGG GAC的ACG的造影GGA热重的GAT的GG 3&#39; </td><td> 250 nmole的规模PCR级</td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20适配器乙（200ng/μl） </td><td>顶部</td><td> 5&#39;CTG的AGA公司成飞贲门癌ACA的GGG GAT的AGG的民航局GGC ACA的造影GGG的ATA的GG 3&#39; </td><td> 250 nmole的规模PCR级</td></tr><tr><td>博特</td><td> 5&#39;建航管CCC认证的TGT GTG建炉TGC税务师台泥建糖耐量GCG TGT的反恐活动星系核的N 3“ </td><td> 250 nmole的规模PCR级</td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina公司的神经网络适配器</td><td>顶部</td><td> 5&#39;ACA的反恐TTT CCC认证交咨会ACG的ACG的反恐交委会海巡署TC 3&#39; </td><td> 250 nmole的规模高效液相色谱纯化步骤B，5.4 </td></tr><tr><td>博特</td><td> 5&#39;磷酸 - CGG公司的GAT AAG的AGC的GGT的TCA的GCA的GGA ATG的化学计算公司3&#39; </td><td> 250 nmole的规模高效液相色谱法净化磷酸的5&#39;端，请参阅步骤B，5.4 </td></tr><tr><td> Illumina的1-454（前锋）引物（10μM） </td><td colspan="2"> 5，亚洲空运中心的GAT ACG的图文影像集团行政协调行政协调GAG的空中交通管制交咨会行政协调会税务师台泥建GTG炉TGC CTT的G 1“ </td><td> 250 nmole的规模PCR级</td></tr><tr><td> Illumina的2-454（反向）引物（10μM） </td><td colspan="2"> 5&#39;GCA的棉酚民航局海关总署GGC ATA的海巡署的GAT CGG公司台泥空管TCA的台泥CTG的总工会GTC的3&#39; </td><td> 250 nmole的规模PCR级</td></tr><tr><td> 1.1定量PCR引物（10μM） </td><td colspan="2"> 5&#39;亚洲空运中心的GAT ACG的图文影像集团行政协调行政协调聚糖3&#39; </td><td> 10nmole规模PCR级</td></tr><tr><td> 2.1定量PCR引物（10μM） </td><td colspan="2">民航局贲门癌棉酚海关总署5&#39;GGC ATA的海巡署3&#39; </td><td> 10nmole规模PCR级</td></tr><tr><td> 3-454 Illumina的测序引物（100μM） </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC的CAT CTG的交委会建CCC认证的TGT反恐公司3&#39; </td><td> 100nmole规模高效液相色谱纯化</td></tr><tr><td> 4-454 Illumina的测序引物（100μM） </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG建TGC税务师台泥建糖耐量图文影像集团的TGT反恐公司3&#39; </td><td> 100nmole规模高效液相色谱纯化</td></tr></tbody></table> 寡核苷酸和适配器表。综合DNA技术（IDT）的连接器和适配器，并准备在以同样的方式订购寡核苷酸前面所述10。半连接器和适配器，可事先准备和存放于-20℃的几个月

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

基因组被组织成三维结构，采用高阶构内，2，12微米大小的核空间。这样的架构是不是随机的，涉及13基因启动子调控元件之间的相互作用。具体的调控序列的转录因子结合，带来了网络的转录调控和协调1，14。 配对末端标签测序（嘉PET）的染色质相互作用分析，以确定这些高阶染色质结构5,6。细胞是固定的，相互作用的位点是由共价DNA-蛋白质交联抓获。为了尽量减少非特异性噪声和降低复杂性，以及增加特异性染色质相互作用分析，染色质免疫沉淀（ChIP）是用来对付特定的蛋白质因子丰富接近结扎前的染色体片段的利益。随后结扎涉及半交联剂对一起拴在个别染色质复合物的DNA片段之间形成的共价链接。的侧翼MmeI，限制在一半交联剂酶切位点，允许提取配对结束后MmeI消化标记链接标记构造（PETS）。作为交联剂一半是生物素，这些PET结构采用链霉亲和磁珠纯化。纯化的宠物结扎与新一代测序适配器和通过下一代，如Illumina的Genome Analyzer的时序产生相互作用的片段目录。映射和生物信息学分析，然后进行识别芯片浓缩铀的结合位点和芯片丰富的染色质相互作用8。 我们已经制作了一个视频演示，CHIA-PET的协议，特别是芯片制备的关键方面，由于芯片的质量起到了重要作用，在的嘉PET库结果。由于协议很长的，唯一的关键步骤是在视频显示。

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Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

配对末端标签测序（嘉PET）的染色质相互作用分析方法是<em&gt;从头</em&gt;染色质相互作用的检测，为更好地理解转录调控。

配对末端标签测序（嘉PET）测绘染色质相互作用和了解转录调控染色质相互作用分析

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

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一个人脑组织中的染色质含量

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

科研

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