Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

De auteurs worden ondersteund door A * STAR van Singapore. Daarnaast wordt MJF ondersteund door een A * STAR National Science Scholarship, een L&#39;Oreal For Women in Science National Fellowship en een Lee Kuan Yew post-doctorale beurs. YR wordt ondersteund door NIH CODEREN subsidies (R01 HG004456-01 en R01 HG003521-01). De auteurs erkennen ook de videografie team van 8 pixels Productions, Singapore, in het bijzonder de heer Kelvin Issey, de heer Chang Kai Xiang en de heer Sherwin Gan voor het filmen van de scènes, mevrouw Siti Rahim voor videobewerking en mevrouw Michelle Teo voor de voice-over.

<ol>
	<li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB1+packages+densely+looped,+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes.">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li><li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+replication+and+transcription.">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li><li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states.">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li><li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei.">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li><li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing.">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22 (2010).</li><li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation.">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li><li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis.">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12 (2007).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li><li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+at+a+distance:+DNA-looping+and+initiation+of+transcription.">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li><li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Chia-PET is een methode ontwikkeld om lange afstand interacties in transcriptieregulatie te identificeren. Een van de kritische factoren die de kwaliteit van een Chia-PET-bibliotheek te bepalen, is de kwaliteit van ChIP materiaal. Het protocol in beeld omvat het gebruik van EGS en formaldehyde te verknopen de cellen. Het gebruik van formaldehyde gecombineerd met een tweede reagens verknopen met een langere spacer arm kunnen helpen bij de binding van eiwitten die niet kunnen worden gebonden formaldehyde alleen 3,11,15. Wij hebben gebouwd bibliotheken met deze methode, die hebben aangetoond robuuste bindingsplaatsen en lange afstand interacties 9. Echter, de verknoping en chip voorwaarden moet worden geoptimaliseerd voor elke factor van belang, en het is belangrijk niet te over-crosslink als te veel verknoping zal resulteren in problemen met fragmentatie door sonicatie, en mogelijk kan resulteren in valse chromatine interacties . Chromatine interactiesgeïdentificeerd door Chia-PET moet gevalideerd worden door een andere methode, zoals fluorescentie in-situ hybridisatie 4. We raden een minimum van 100 ng van chromatine materiaal. Hoewel we hebben gebouwd van goede kwaliteit bibliotheken uit 50 ng van chromatine materiaal, hebben we vastgesteld dat grote hoeveelheden uitgangsmateriaal mag de bouw van Chia-PET bibliotheken met minder dan 16 PCR-cycli, om zo amplicons en redundantie van elke bibliotheek. Deze lagere redundantie geassocieerd met meer unieke toegewezen labels en een hoog percentage aan gegevens, waardoor een vollediger chromatine interactie kaart met minder banen van sequencing. De laatste verpakt volume van kralen in elke buis moet 50 pl en 100 ul voor magnetische en Sepharose kralen respectievelijk. Als het verpakte kraal volume kleiner is dan aangegeven, te brengen tot het minimum vol volume met dezelfde pre-goedgekeurde blanco magnetische of Sepharose kralen om het verlies van DNA-dragende kraal een minimum te beperkens in latere stappen. Afgezaagde tips of grote-core tips moet worden gebruikt voor het pipetteren Sepharose kralen. De volgende wijzigingen zijn verwerkt naar aanleiding van de eerder gepubliceerde Chia-PET-protocol 5. Ten eerste zijn magnetische G kralen die voor de monsterneming verlies te minimaliseren tijdens het wassen. Bovendien identificeerden we niet-specifieke banden met afmetingen van ongeveer 100 bp en 138 bp zijn amplicons van zelf-geligeerde half-linkers en / of adapters. Daarom hebben we verminderde concentratie van gebiotinyleerde half-linkers en 454 GS20 adapters niet-specifieke banden minimaliseren PCR amplificatie. De nabijheid ligatie volume werd teruggebracht van 50 ml tot 10 ml tot monster verlies te minimaliseren tijdens de daaropvolgende zuivering stappen en ook besparen op de kosten reagens. We hebben ook verhoogde de incubatietijd naar Chia-PET DNA geïmmobiliseerd om de parels tot de maximale vangst van Chia-PET-DNA op de streptavidine kralen te garanderen. In de nabijheid ligatie stap chimère ligaties that niet het ware in vivo chromatine interacties onvermijdelijk opgewekt in een niet-specifieke en willekeurige wijze. Derhalve de kwaliteit van gegevens van een chia-PET experiment evalueren, wordt de snelheid van chimerisme geschat uit het gebruik van twee verschillende halve linkers specifieke nucleotide barcodes TAAG en ATGT 5. Na high-throughput sequencing, de chia-PET sequenties eerst geanalyseerd linker barcode samenstelling en sequenties afgeleid van specifieke ligatieproducten en aspecifieke ligatieproducten onderscheiden 8. Het percentage van bekende hersenschimmen (dat wil zeggen heterodimeren AB linkers) die aanwezig zijn in onze in-house MCF-7 RNA polymerase II Chia-PET bibliotheken is minder dan 15%. Chia-PET-sequenties worden vervolgens ingedeeld in twee categorieën, namelijk zelf-ligatie de persoonlijke levenssfeer en inter-ligatie levenssfeer. Self-ligatie Huisdieren zijn verkregen uit zichzelf circularization ligatie van de chromatine fragmenten en daarbij onder-ligatie Huisdieren zijn afgeleid van inter-ligatie tussen twee DNA-fragmenten. Dit laatste is dan onderverdeeld in drie verschillende categorieën op basis van de genomische afstand van elke tag op hetzelfde chromosoom (intrachromosomale inter-ligatie PET&#39;s) of dat beide tags zijn toegewezen aan twee verschillende chromosomen (interchromosomal inter-ligatie huisdieren). We hebben een Chia-PET hulpmiddel softwarepakket te sorteren op de verschillende categorieën 8. Dit wordt gebaseerd op DNA-fragmenten die in de bibliotheek. In het algemeen zal kleiner ChIP fragmenten geven een hogere resolutie en de afgesneden voor deze RNA-polymerase II Chia-PET bibliotheken is ongeveer 4 kb. Bovendien echte chromatine interacties kunnen worden onderscheiden van ruis door telling van het aantal onderling ligatie technologieën in een interactie cluster, met andere woorden een cluster van hoge PET aantal aldus een hogere kans een echt chromatine interactie 8 hebben . Om onze valse positieven te filteren eenstijgen van hoog verrijkt ankers die onder-ligatie persoonlijke levenssfeer kunnen vormen door toeval, heeft een statistische analyse kader ook is geformuleerd om goed voor willekeurige vorming van een inter-ligatie gezelschapsdieren tussen twee ankers 8. Kortom, de Chia-PET-techniek maakt het mogelijk in kaart brengen van chromatine interactie netwerken op een wereldwijde schaal. De implementatie van ChIP in Chia-PET kan de vermindering van de bibliotheek complexiteit en achtergrondgeluiden. Bovendien ChIP voegt specificiteit van chromatine interacties, waardoor het onderzoek van specifieke chromatine interacties bij bepaalde transcriptiefactoren 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 4-20% gradiënt TBE gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> Stap B 6,3 </td></tr><tr><td> 5 x T4 DNA ligase buffer met PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> Stap B, 2.2 </td></tr><tr><td> 6% TBE gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> Stap B 6,8 </td></tr><tr><td> Agilent DNA-100 test </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> Stap B, 7.1 </td></tr><tr><td> Agilent Hoge gevoeligheid DNA-test </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> Centrifugeer Tube Filters (Spin-X) </td><td> Corning &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> Stap B, 3.7 en 6.9 </td></tr><tr><td> Dark Reader transilluminator </td><td> Clare Chemisch Onderzoek </td><td> DR46B </td><td> Stap B 6,8 </td></tr><tr><td> Digitale Sonifier Cell Disrupter </td><td> Branson </td><td> 450D-0101063591 </td><td> Stap A, 4,3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 magneet (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Stap A, 7.5.1 Stap B, voor alle magnetische korrels wasstappen </td></tr><tr><td> DynaMag-15 Magneet (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> Stap A, 5 en 6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> Stap B 6,5 </td></tr><tr><td> Escherichia coli DNA polymerase I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> Stap B 5,6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </td&gt; <td> Stap A, 7.5.1 Stap B, 4.3 en 6.5 </td></tr><tr><td> Illumina CBOT Cluster Generation System </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> Stap B, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina Genome Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> Stap B, 7,5 </td></tr><tr><td> Illumina PE primers </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Stap B, 5.4 (indien nodig) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico Biotech </td><td> RM-2L </td><td> Stap B, een incubatie met rotatie </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-time PCR-systeem </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> Stap A, 7.5.3 Stap B, 7,3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Stap B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 Streptavidine Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> Stap B, 5,2 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Magnetische (Dynabeads) Proteïne G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> Stap A, 5.1.1 en 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract High Density (2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> Stap A, 7.5.1 </td></tr><tr><td> MaXtract High Density (50 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> Stap B, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNase ONE Ribonuclease </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> Stap B, 4.8 </td></tr><tr><td> RNA polymerase II (8WG16) monoklonaal antilichaam </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> Stap A, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge centrifugebuis (polypropyleen) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> Stap A, 3.1 </td></tr><tr><td> Oak Ridge centrifugebuis (Teflon FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> Stap B, 4.3 </td></tr><tr><td> Phusion High Fidelity Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Stap B, 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (Quant-iT) dsDNA Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> Stap A, 7.5.2 </td></tr><tr><td> Polystyreen Ronde Bottom Test Tube </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> Stap A, 4,1 </td></tr><tr><td> Proteaseremmer Cocktail Tabletten (compleet, EDTA-vrij) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Stap A, 1.6 verder </td></tr><tr><td> Proteïnase K Solution (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> Stap A, 4.4, 7.5.1 Stap B, 4,1 </td></tr><tr><td> T4 DNA ligase </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Stap B, 2.2, 3.9 en 5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA-ligase buffer (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Stap B, 3.3 en 3.9 </td></tr><tr><td> T4-DNA-polymerase </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>Stap B 1,2 </td></tr><tr><td> T4 DNA polynucleotidekinase </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> Stap B, 3,3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Kit v5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Regenten voor Illumina Genome Analyzer IIx systeem </td></tr><tr><td> TruSeq PE Cluster Kit v2-CBOT-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> om gebruik te maken met de Illumina CBOT Cluster Generation systeem </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Stap B, 6.3 en 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Stap B, 6.3 en 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td colspan="2"> Volgorde </td><td> Reacties </td></tr><tr><td rowspan="2"> Gebiotinyleerde half-linkers A (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd Interne Biotine dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd </td></tr><tr><td rowspan="2"> Gebiotinyleerde half-linkers B (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT AAC TCC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd Interne Biotine dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATG GTT GGA TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd </td></tr><tr><td rowspan="2"> Niet-gebiotinyleerde half-linkers (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GAT GGC CGC ATC GGA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptor A (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;CCA TCT CCC CAT TGC TCC GTG CATCTG CCT TTC CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adapter B (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;CTG AGA CAC GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATC CCT CCC TGT GTG CCT CTA TGC TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN-adapters </td><td> Top </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd Zie Stap B, 5.4 </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;phos - GAT AAG CGG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd gefosforyleerd 5 &#39;einde Zie Stap B, 5.4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (vooruit) primer (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (achteruit) primer (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA CGG GAT TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 1.1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG OP 3&#39; </td><td> 10nmole schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 2.1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC CGA ATA 3&#39; </td><td> 10nmole schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 sequencing primer (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG CCT TTC CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole schaal HPLC gezuiverd </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 sequencing primer (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT CTA TGC TCC CCT GTT GCG TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole schaalHPLC Gezuiverd </td></tr></tbody></table> Tabel oligo en adapters. Order oligo van geïntegreerde DNA Technologies (IDT) en bereid linkers en adapters op dezelfde wijze als eerder beschreven 10. Half-linkers en adapters kunnen vooraf worden bereid en enkele maanden bij -20 ° C.

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

Genomen zijn georganiseerd in drie-dimensionale structuren, de vaststelling van hogere-orde-conformaties in de microscopisch kleine nucleaire ruimtes 7, 2, 12. Dergelijke architecturen zijn niet willekeurig en actie tussen genpromoters en regulerende elementen 13. De binding van transcriptiefactoren specifieke regulerende sequenties brengt een netwerk van transcriptie-regulatie en coördinatie 1, 14. Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is ontwikkeld om te identificeren deze hogere-orde chromatine structuren 5,6. Cellen zijn vast en interactie loci worden opgevangen door covalente DNA-eiwit cross-links. Om niet-specifieke geluid te minimaliseren en de complexiteit te verminderen en om de specificiteit van de chromatine interactie analyse te verhogen, wordt chromatine immunoprecipitatie (ChIP) gebruikt tegen specifiek eiwit factoren om chromatine fragmenten van belang te verrijken voor de nabijheid van ligatie. Ligatie met half-linkers vormt vervolgens covalente banden tussen paren van DNA-fragmenten bij elkaar binnen de afzonderlijke complexen chromatine vastgebonden. De flankerende MmeI restrictie-enzym sites in de half-linkers maken extractie van gepaarde eind-tag-linker-tag constructies (PET&#39;s) op MmeI spijsvertering. Aangezien de halve linkers gebiotinyleerd worden deze constructen PET gezuiverd met streptavidine-magnetische korrels. Het gezuiverde Huisdieren zijn geligeerd met next-generation sequencing adapters en een catalogus van op elkaar inwerkende fragmenten wordt gegenereerd via de volgende generatie sequencers zoals de Illumina Genome Analyzer. Mapping en bio-informatica analyse wordt vervolgens uitgevoerd om ChIP verrijkt bindingsplaatsen en chip-verrijkte chromatine interacties 8 geven. Wij hebben een video om kritische aspecten van de Chia-PET-protocol, in het bijzonder de voorbereiding van de microchip aan te tonen als de kwaliteit van ChIP speelt een belangrijke rol in de uitkomst van een Chia-PET-bibliotheek. Aangezien de protocollenlang, slechts de kritische stappen in de video.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is een methode voor<em&gt; De novo</em&gt; Detectie van chromatine interacties, voor een beter begrip van transcriptionele controle.

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Single Lees en Gepaarde End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken van 10 nanogram Totaal RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van Drosophila Weefsel

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Biochemische assays voor het analyseren van activiteiten van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling Enzymen

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...