Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Die Autoren werden von A * STAR Singapur unterstützt. Darüber hinaus wird durch eine MJF A * STAR National Science Scholarship, ein L&#39;Oreal For Women in Science Fellowship Nationale und Lee Kuan Yew Postdoc-Stipendium unterstützt. YR ist durch NIH ENCODE Zuschüsse (R01 HG004456-01 und R01 HG003521-01) unterstützt. Die Autoren erkennen die Videografie Team von 8 Pixel Productions, Singapur, insbesondere Herr Kelvin Issey, Mr. Chang Xiang Kai und Herr Sherwin Gan für die Dreharbeiten der Szenen, Frau Siti Rahim für die Videobearbeitung und Frau Michelle Teo für die Voice-Over.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

CHIA-PET ist eine Methode entwickelt, um weitreichende Wechselwirkungen in Transkriptionsregulation identifizieren. Einer der kritischen Faktoren, die die Qualität eines CHIA PET-Bibliothek bestimmen, ist die Qualität der Chip-Material. Das Protokoll, in dem Video gezeigt, beinhaltet die Verwendung von EGS und Formaldehyd zu vernetzen die Zellen. Die Verwendung von Formaldehyd mit einem zweiten Vernetzungsmittel mit längerer Spacer-Arm, kann die Bindung von Proteinen, die nicht allein durch Formaldehyd gebunden 3,11,15 könnte helfen. Wir haben Bibliotheken mit dieser Methode, die robust Bindungsstellen und weitreichenden Wechselwirkungen 9 gezeigt haben, gebaut. Jedoch kann die Vernetzung und ChIP Bedingungen sollen für jeden Faktor von Interesse optimiert werden, und es ist wichtig, nicht zu stark vernetzt, wie viel der Vernetzung in Schwierigkeiten bei der Fragmentierung durch Beschallung führt und möglicherweise zu falschen Chromatin-Wechselwirkungen führen . Chromatin-Wechselwirkungenidentifiziert von Chia-PET sollte nach einem anderen Verfahren, wie die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung 4 validiert werden. Wir empfehlen einen Mindestabstand von 100 ng von Chromatin Material. Während wir gute Qualität Bibliotheken aus 50 ng von Chromatin Material konstruiert haben, haben wir beobachtet, dass große Mengen an Ausgangsmaterial erlaubt Bau von Chia-PET-Bibliotheken mit weniger als 16 PCR-Zyklen und minimiert dadurch Amplikons und Redundanz der einzelnen Bibliotheken. Diese geringere Redundanz mit höheren einmaligen abgebildet Tags und auch einem hohen Anteil an verwertbaren Daten korreliert, wodurch eine umfassendere Interaktion Chromatin Karte mit weniger Fahrspuren der Sequenzierung. Das endgültige Volumen der Kugeln verpackt in jedem Rohr sollte 50 ul und 100 ul für magnetische und Sepharosekügelchen betragen. Wenn die Raupe gepackten Volumen ist kleiner als angegeben, auf das Minimum verpackt Volumen mit ähnlich bereits geklärten unbespielten magnetischen oder Sepharosekügelchen bringen, um den Verlust von DNA-tragenden Wulst minimierens in den nachfolgenden Schritten. Abgesägte Tipps oder großen Kern-Tipps sollten zum Pipettieren Sepharosekügelchen verwendet werden. Folgende Modifikationen wurden nach dem zuvor veröffentlichten CHIA-PET-Protokoll 5 eingearbeitet. Erstens wurden magnetische Beads G verwendet werden, um durch Verluste während Wäschen zu minimieren. Darüber hinaus haben wir festgestellt, unspezifische Banden mit den ungefähren Größen von 100 bp und 138 bp bis Amplikons von selbst ligiert, Halb-Linker oder / und Adapter sein. Daher konnten wir die Konzentration von biotinyliertem halb Linker und 454 GS20 Adapter unspezifische Banden während der PCR Amplifikation zu minimieren. Die Ligationssysteme Volumen von 50 ml bis 10 ml eingeengt, um durch Verluste während nachfolgenden Reinigungsschritte zu minimieren und auch an Reagenz zu sparen. Wir erhöhte auch die Inkubationszeit nach Chia-PET-DNA zu immobilisieren Perlen, um eine maximale Aufnahme von Chia-PET-DNA auf den Streptavidinbeads zu gewährleisten. Während der Nähe Ligationsschritt, chimäre Ligierungen that nicht die wahre in vivo Chromatin-Wechselwirkungen zwangsläufig in einer nicht-spezifischen und zufällige Weise erzeugt. Um daher die Qualität der Daten von jedem CHIA-PET Erfahrung zu evaluieren, wird die Geschwindigkeit des Chimärismus aus der Verwendung von zwei unterschiedlichen Halbwertszeiten Linker mit spezifischen Nukleotid Barcodes TAAG und ATGT 5 geschätzt. Nach dem Hochdurchsatz-Sequenzierung, werden die Chia-PET-Sequenzen zunächst für Barcode-Linker Zusammensetzung und spezifische Sequenzen aus Ligationsprodukte und unspezifische Ligationsprodukte abgeleitet analysiert unterschieden werden 8. Der Prozentsatz der bekannten Chimären (dh Heterodimere AB Linker e) in der hauseigenen MCF-7-RNA-Polymerase II CHIA-PET-Bibliotheken weniger als 15% ist. CHIA PET-Sequenzen anschließend in zwei Kategorien, nämlich Selbst-Ligation Privatsphäre und inter-Ligation Tierbörse. Selbst-Ligation HAUSTIERE sind aus selbständiger Zirkularisierung Ligation der Chromatin-Fragmente erhalten werden, während inter-Ligation Haustiere von i abgeleitet werdennter-Ligation zwischen zwei verschiedenen DNA-Fragmente. Letzteres ist dann in drei verschiedene Kategorien auf der genomischen Abstand von jedem Tag auf dem gleichen Chromosom (intrachromosomale inter-Ligation PET) oder dass beide Variablen werden auf zwei verschiedenen Chromosomen (interchromosomale inter-Ligation PETs) abgebildet basierend unterteilt. Wir haben eine CHIA-PET-Tool-Software-Paket zum Aussortieren der verschiedenen Kategorien 8 entwickelt. Dies wird auf der DNA-Fragmente, die in der Bibliothek gründen. Im Allgemeinen werden kleinere Chip-Fragmente geben eine höhere Auflösung und die sich für diese RNA Polymerase II CHIA-PET-Bibliotheken zugeschnitten ist ca. 4 kb. Darüber hinaus realen Chromatin-Wechselwirkungen von Rauschen kann durch Zählen der Anzahl von inter-Ligation Privatsphäre in einer Interaktion Cluster zu unterscheiden, mit anderen Worten, wird eine Gruppe von PET hohen Anzahl der eine höhere Wahrscheinlichkeit hat, eine echte Wechselwirkung Chromatin 8 weisen . Um unsere Fehlalarme Filter Asteigen von hoch angereichertem Anker, die inter-Ligation Privatsphäre durch Zufall entstehen kann, ist eine statistische Analyse Rahmen auch formuliert worden, um für zufällige Bildung aller zwischenzeitlich Ligation PETs zwischen zwei Ankern 8 ausmachen. Im Ergebnis ermöglicht das Chia-PET-Technik die Abbildung Chromatin Interaktion Netzwerke auf globaler Ebene. Die Umsetzung der ChIP in Chia-PET ermöglicht die Reduzierung der Komplexität und der Bibliothek Hintergrundrauschen. Darüber hinaus fügt ChIP Spezifität für Chromatin-Wechselwirkungen, so dass die Untersuchung von Wechselwirkungen mit spezifischen Chromatin bestimmte Transkriptionsfaktoren 5 zugeordnet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Gradienten von 4-20% TBE-Gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> Schritt B, 6.3 </td></tr><tr><td> 5 x T4 DNA-Ligase-Puffer mit PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> Schritt B, 2.2 </td></tr><tr><td> 6% TBE-Gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> Schritt B, 6.8 </td></tr><tr><td> Agilent DNA-Test 100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> Schritt B, 7,1 </td></tr><tr><td> Agilent High Sensitivity DNA-Test </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> Reaktionsgefäßständer Filter (Spin-X) </td><td> Corning &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> Schritt B, 3,7 und 6,9 </td></tr><tr><td> Dunkle Reader Transilluminator </td><td> Clare Chemical Research </td><td> DR46B </td><td> Schritt B, 6.8 </td></tr><tr><td> Digitale Sonifier Zelle Disrupter </td><td> Branson </td><td> 450D-0101063591 </td><td> Schritt A, 4.3 </td></tr><tr><td> Dynamag-2 Magneten (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Schritt A, 7.5.1 Schritt B für alle magnetischen Kügelchen Waschschritte </td></tr><tr><td> Dynamag-15 Magnet (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> Schritt A, 5 und 6 </td></tr><tr><td> Dynamag-PCR (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> Schritt B, 6,5 </td></tr><tr><td> Escherichia coli-DNA-Polymerase I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> Schritt B, 5.6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </td&gt; <td> Schritt A, 7.5.1 Schritt B, 4,3 und 6,5 </td></tr><tr><td> Illumina CBOT Cluster-Generation System </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> Schritt B, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina Genome Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> Schritt B, 7,5 </td></tr><tr><td> Illumina PE-Primer </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Schritt B, 5,4 (falls erforderlich) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico Biotech </td><td> RM-2L </td><td> Schritt B, keine Inkubationen mit Rotation </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR-System </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> Schritt A, 7.5.3 Schritt B, 7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Schritt B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 Streptavidin Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> Schritt B, 5.2 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Magnetische (Dynabeads) Protein G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> Schritt A, 5.1.1 und 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract High Density (2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> Schritt A, 7.5.1 </td></tr><tr><td> MaXtract High Density (50ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> Schritt B, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNase ONE Ribonuclease </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> Schritt B, 4,8 </td></tr><tr><td> RNA-Polymerase II (8WG16) monoklonaler Antikörper </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> Schritt A, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Zentrifugenröhrchen (Polypropylen) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> Schritt A, 3.1 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Zentrifugenröhrchen (Teflon FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> Schritt B, 4.3 </td></tr><tr><td> PHUsIonen-High-Fidelity-Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Schritt B, 6 </td></tr><tr><td> PicoGreen (Quant-iT) dsDNA Reagenz </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> Schritt A, 7.5.2 </td></tr><tr><td> Polystyrol Rundboden Test Tube </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> Schritt A, 4.1 </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor Cocktail Tablets (komplett, EDTA-frei) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Schritt A, 1,6 ab </td></tr><tr><td> Proteinase K-Lösung (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> Schritt A, 4.4, 7.5.1 Schritt B, 4.1 </td></tr><tr><td> T4 DNA-Ligase </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Schritt B, 2.2, 3.9 und 5.4 </td></tr><tr><td> T4-DNA-Ligase-Puffer (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Schritt B, 3.3 und 3.9 </td></tr><tr><td> T4 DNA-Polymerase </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>Schritt B, 1,2 </td></tr><tr><td> T4-DNA-Polynukleotidkinase </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> Schritt B, 3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Kit v5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Regents für Illumina Genome Analyzer IIx-System </td></tr><tr><td> TruSeq PE Cluster Kit v2-CBOT-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> auf den Einsatz mit Illumina CBOT Cluster Generation System sein </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Schritt B, 6.3 und 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell Elektrophorese-System </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Schritt B, 6.3 und 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td colspan="2"> Reihenfolge </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinyliertes halben Linker A (200ng/μl) </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC gereinigte Interne Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC-gereinigten </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinyliertes halben Linker B (200ng/μl) </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;CGC GGC GA / iBiodT / ATA-CAT TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC gereinigte Interne Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATG GTT GGA TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC-gereinigten </td></tr><tr><td rowspan="2"> Nicht biotinylierte Halb-Linker (200ng/μl) </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;GGC CGC GGA TCC ATC GAT AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC ATC GAT GC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adapter A (200ng/μl) </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCC CATCTG CCT CCC TTC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC TGG AGA GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptor B (200ng/μl) </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;CTG AGA CAC ACA GCA GGG GAT AGG CAA CAG ACA GGC GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;CCT ATC CCC GTG TGT CCT TGC CTA TCC CCT GTT TGT CTC GCG AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN-Adaptern </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT ACG ACG CCC TAC CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC gereinigte Siehe Schritt B, 5,4 </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;Phosphat - GAT CGG AAG AGC TCA GCA GGT GGA CCG ATG AG 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC gereinigten phosphorylierten 5&#39;-Ende Siehe Schritt B, 5,4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (Vorwärts)-Primer (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GCG GAT ACG ACC ACC ATC GAG TAC CTA ACC TCC TGC CTT CCT GTG G 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (Reverse)-Primer (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 1.1 (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GCG GAT ACG ACC ACC GAG bei 3&#39; </td><td> 10nmole Skala PCR Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 2.1 (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole Skala PCR Grade </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 Sequenzierprimers (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG CCT CCC TTC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole Maßstab HPLC-gereinigten </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 Sequenzierprimers (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT TGT GCG CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole SkalaHPLC-gereinigten </td></tr></tbody></table> Tabelle von Oligos und Adapter. Auftrag Oligos von Integrated DNA Technologies (IDT) und bereiten Linker und Adapter in der gleichen Weise wie zuvor beschrieben 10. Half-Linker und Adapter kann vorher hergestellt werden und für mehrere Monate bei -20 ° C gelagert

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

Genome werden in dreidimensionale Strukturen auf, die zur Annahme höherer Ordnung Konformationen innerhalb der Mikrometergröße nuklearen Räumen 7, 2, 12. Solche Architekturen sind nicht zufällig und beinhalten Wechselwirkungen zwischen Gen-Promotoren und regulatorische Elemente 13. Die Bindung von Transkriptionsfaktoren an regulatorische Sequenzen bewirkt ein Netzwerk der Transkriptionssteuerung und Koordinierung 1, 14. Chromatin Interaction Analysis von Paired-End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) wurde entwickelt, um erkennen diese höherer Ordnung Chromatinstrukturen 5,6. Die Zellen werden fixiert und wechselwirkenden Loci durch kovalente DNA-Protein-Vernetzungen erfasst. Um nicht-spezifische Geräusche zu minimieren und die Komplexität zu reduzieren, sowie um die Spezifität des Chromatins Interaktionsanalyse zu erhöhen, wird Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) gegen spezifische Protein-Faktoren verwendet, um Chromatin-Fragmente von Interesse vor Ligationssysteme bereichern. Ligation mit Halb-Linker bildet anschließend kovalente Verbindungen zwischen Paaren von DNA-Fragmenten zusammen innerhalb einzelner Chromatin-Komplexe gebunden. Die flankierenden MmeI Restriktionsenzymstellen in den Halb-Linker erlauben Extraktion von gepaarten End-Tag-Linker-Tag-Konstrukte (PET) auf MmeI Verdauung. Da die halbe Linker biotinyliert werden, werden diese PET-Konstrukte unter Verwendung Streptavidin-magnetischen Kügelchen. Die gereinigten Haustiere sind mit Next-Generation-Sequencing-Adapter und einem Katalog von wechselwirkenden Fragmente erfolgt über Next-Generation-Sequenzern wie dem Illumina Genome Analyzer generiert ligiert. Mapping und bioinformatische Analyse wird dann durchgeführt, um ChIP angereicherte Bindungsstellen und Chip-angereicherten Chromatin-Wechselwirkungen 8 zu identifizieren. Wir haben ein Video produziert, um kritische Aspekte des Chia-PET-Protokoll, insbesondere die Vorbereitung der ChIP demonstrieren, wie die Qualität von CHIP spielt eine wichtige Rolle für das Ergebnis eines CHIA-PET-Bibliothek. Da die Protokollesehr lang, werden nur die kritischen Schritte in dem Video gezeigt.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis von Paired-End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) ist eine Methode zur<em&gt; De-novo-</em&gt; Nachweis von Chromatin-Wechselwirkungen, zum besseren Verständnis der transkriptionellen Kontrolle.

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

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