Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

החוקרים נתמכים על ידי כוכב * של סינגפור. בנוסף, עמיתי ירושלים נתמך על ידי מלגה * STAR הלאומית למדע, לוריאל למען נשים במדע הלאומי ואת אחוות לי קואן יו פוסט דוקטורט מלגה. YR נתמך על ידי NIH המקודדים מענקים (R01 HG004456-01 ו-R01 HG003521 01). החוקרים גם להכיר את צוות videography של 8 הפקות פיקסלים, סינגפור, במיוחד מר קלווין איסיי, מר צ&#39;אנג קאי שיאנג ומר שרווין גן לצילום הקלעים, גב &#39;Siti רחים עבור עריכת וידאו ו גב&#39; מישל עבור Teo קריינות.

<ol>
	<li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB1+packages+densely+looped,+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes.">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li><li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+replication+and+transcription.">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li><li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states.">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li><li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei.">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li><li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing.">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22 (2010).</li><li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation.">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li><li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis.">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12 (2007).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li><li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+at+a+distance:+DNA-looping+and+initiation+of+transcription.">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li><li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Chia-PET היא שיטה שפותחה כדי לזהות ארוכי טווח אינטראקציות ויסות שעתוק. אחד הגורמים הקריטיים הקובעים את איכות ספריית Chia-PET הוא איכות החומר שבב. פרוטוקול רואים בסרט משלבת את השימוש EGS ו פורמלדהיד לחצות קישור תאים. השימוש של פורמלדהיד, בשילוב עם מגיב cross-linking 2 נושאת זרוע spacer עוד עשוי לסייע מחייב של חלבונים אשר לא יכול היה להיות מחויב פורמלדהיד לבד 3,11,15. בנינו ספריות בשיטה זו אשר הוכיחו אתרי הקישור חזקים ארוכי טווח אינטראקציות 9. עם זאת, cross-linking ותנאי שבב צריך להיות מותאם עבור כל גורם של עניין, וזה חשוב לא יתר על המידה crosslink כמו יותר מדי cross-linking תגרום קשיים הפיצול על ידי sonication, ואולי ואולי לגרום אינטראקציות הכרומטין מזויף . הכרומטין אינטראקציותמזוהה על ידי Chia-PET יש תוקף בשיטה אחרת, כמו הכלאה באתרו הקרינה 4. אנו ממליצים על מינימום של 100 ng חומר הכרומטין. בעוד בנינו ספריות באיכות טובה מ 50 ng של חומר הכרומטין, ראינו כי כמויות גדולות של חומר המוצא אפשרה בניית Chia-PET ספריות עם פחות מ 16 מחזורים PCR, amplicons ובכך לצמצם ויתירות של כל ספרייה. זה מתואם עם יתירות נמוכה יותר תגיות ממופה ייחודיים גם אחוז גבוה של נתונים שימושיים, ובכך שהיא מאפשרת אינטראקציה מקיפה יותר הכרומטין מפה עם מסלולים פחות של רצף. נפח ארוז הסופי של חרוזים בצינור זה צריך להיות 50 μl של 100 μl של חרוזים מגנטיים Sepharose בהתאמה. אם נפח חרוז ארוז הוא פחות מ כאמור, להביא לנפח ארז מינימום עם חרוזים מגנטיים או Sepharose דומה מראש פינה ריקים כדי להקטין את איבוד של ה-DNA נושאות חרוזזה בשלבים הבאים. המקוצרות טיפים או גדול ליבות עצות יש להשתמש pipetting חרוזים Sepharose. שינויים הבאים שולבו לאחר שפורסם קודם לכן Chia-PET פרוטוקול 5. ראשית, חרוזים מגנטיים ז שימשו כדי להקטין את איבוד מדגם במהלך שוטף. בנוסף, זיהינו שאינם ספציפיים להקות עם משוערים של 100 BP ו 138-BP להיות amplicons של עצמי ligated למוצרי linkers וחצי ו / או מתאמים. לפיכך, צמצמנו את ריכוז biotinylated למוצרי linkers וחצי ו 454 GS20 מתאמי למזער שאינם ספציפיים להקות במהלך הגברה PCR. נפח קשירת הקרבה ירד מ 50 מ&quot;ל ל 10 מ&quot;ל כדי להקטין את איבוד מדגם במהלך השלבים הבאים טיהור וגם לחסוך בעלויות מגיב. כמו כן הגדילה את זמן הדגירה לשתק Chia-PET-DNA כדי חרוזים כדי להבטיח לכידת מקסימלי של ה-DNA Chia-PET על חרוזים streptavidin. במהלך שלב קשירת הקרבה, ligations chimeric thaלא לא מייצגים אמת אינטראקציות ב vivo הכרומטין נוצרות באופן בלתי נמנע באופן בלתי ספציפי אקראי. לכן, כדי להעריך את איכות נתוני הניסוי Chia-PET בכלל, בשיעור של chimerism מוערך משימוש שני שונים linkers וחצי עם נוקלאוטיד ברקודים ספציפי TAAG ו ATGT 5. לאחר רצף תפוקה גבוהה, Chia-PET רצפי מנותחים 1 להרכב ברקוד רצפים מקשר נגזר קשירת מוצרים ספציפיים שאינם ספציפיים מוצרי קשירת ניתן להבחין 8. אחוז מפלצות הידועים (כלומר heterodimers linkers א.ב.) הנמצאים בבית שלנו, MCF-7 RNA פולימראז II Chia-PET ספריות הוא פחות מ 15%. Chia-PET רצפים מסווגים לאחר מכן לשתי קטגוריות, כלומר עצמית קשירת חיות מחמד, קשירת בין חיות. עצמי קשירת חיות מחמד לקבל קשירת עצמית circularization של שברי הכרומטין תוך קשירת בין חיות מחמד נגזר אניnter-קשירת בין שני קטעי דנ&quot;א שונים. זו האחרונה היא אז המשנה לחלק לשלוש קטגוריות שונות המבוססות על מרחק גנטי של כל תג על כרומוזום זהה (intrachromosomal קשירת בין PETS) או ששני תגיות ממופים שני כרומוזומים שונים (interchromosomal קשירת בין PETS). פיתחנו Chia-PET כלי תוכנה החבילה למיין את 8 קטגוריות שונות. זו תתבסס על שברי דנ&quot;א הנמצאים בספרייה. באופן כללי, שברים שבב קטן יותר ייתן רזולוציה גבוהה יותר מנותקים אלה השנייה RNA פולימראז Chia-PET הספריות הוא כ 4 קילו. בנוסף, אינטראקציות הכרומטין אמיתיים ניתן להבחין בין רעש אקראי על ידי ספירת מספר קשירת בין PETS באשכול אינטראקציה, כלומר, קבוצה של מספר PET גבוהה הוא אמר שיש סבירות גבוהה יותר להיות אינטראקציה אמיתית הכרומטין 8 . לסינון תוצאות חיוביות שגויות שלנולעלות מ עוגנים מועשר שיכול ליצור קשירת בין PETS במקרה אקראי, במסגרת ניתוח סטטיסטי יש גם פותח על מנת להסביר את היווצרות אקראית של כל קשירת בין PETS בין שני עוגנים 8. לסיכום, הטכניקה Chia-PET מאפשר מיפוי רשתות אינטראקציה הכרומטין בקנה מידה עולמי. יישום שבב ב Chia-PET מאפשר הפחתת המורכבות ספריה רעשי רקע. כמו כן, שבב מוסיף הספציפיות כדי אינטראקציות הכרומטין, המאפשר בחינה של אינטראקציות הכרומטין ספציפיים הקשורים גורמי תעתוק מסוימים 5.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 4-20% שיפוע TBE ג&#39;ל </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> שלב ב &#39;, 6.3 </td></tr><tr><td> 5 x-DNA T4 האנזים מאגר עם PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> שלב ב &#39;, 2.2 </td></tr><tr><td> 6% TBE ג&#39;ל </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> שלב ב &#39;, 6.8 </td></tr><tr><td> Agilent דנ&quot;א 100 Assay </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> שלב ב &#39;, 7.1 </td></tr><tr><td> Agilent רגישות גבוהה DNA Assay </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> סרכזת מסננים תחתית (Spin-X) </td><td> קורנינג &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> שלב ב &#39;, 3.7 ו - 6.9 </td></tr><tr><td> Reader Dark Transilluminator </td><td> קלייר כימית מחקר </td><td> DR46B </td><td> שלב ב &#39;, 6.8 </td></tr><tr><td> Sonifier דיגיטלי נייד משבש </td><td> ברנסון </td><td> 450D-0101063591 </td><td> שלב א &#39;, 4.3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 מגנט (מרוכז חלקיקים מגנטיים) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> שלב ב &#39;, 7.5.1 שלב, לכל חרוזים מגנטיים כביסה צעדים </td></tr><tr><td> DynaMag-15 מגנט (מרוכז חלקיקים מגנטיים) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> שלב א &#39;, 5 ו 6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (מרוכז חלקיקים מגנטיים) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> שלב ב &#39;, 6.5 </td></tr><tr><td> Escherichia coli DNA פולימראז אני </td><td> חוד </td><td> M0209 </td><td> שלב ב &#39;, 5.6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </TD&gt; <td> שלב א &#39;, 7.5.1 שלב ב&#39;, 4.3 ו - 6.5 </td></tr><tr><td> Illumina הדור cBot Cluster מערכת </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> שלב ב &#39;, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina הגנום Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> שלב ב &#39;, 7.5 </td></tr><tr><td> Illumina PE primers </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> שלב ב &#39;, 5.4 (במידת הצורך) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico ביוטק </td><td> RM-2L </td><td> שלב ב &#39;, כל incubations עם סיבוב </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR מערכת </td><td> רוש </td><td> 04 640 268 001 </td><td> שלב א &#39;, שלב ב 7.5.3, 7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR הירוק אני MasterMix </td><td> רוש </td><td> 03 752 186 001 </td><td> שלב ב &#39;, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 streptavidin Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> שלב ב &#39;, 5.2 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> מגנטית (Dynabeads) חלבון G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> שלב א &#39;, 5.1.1 ו 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract בצפיפות גבוהה (2ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> שלב א &#39;, 7.5.1 </td></tr><tr><td> MaXtract בצפיפות גבוהה (50 מ&quot;ל) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> שלב ב &#39;, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> חוד </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNase ONE Ribonuclease </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> שלב ב &#39;, 4.8 </td></tr><tr><td> RNA פולימראז II (8WG16) נוגדנים חד שבטיים </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> שלב א &#39;, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge צינורות צנטריפוגות (פוליפרופילן) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> שלב א &#39;, 3.1 </td></tr><tr><td> Oak Ridge צינורות טפלון צנטריפוגות (FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> שלב ב &#39;, 4.3 </td></tr><tr><td> Phusיון נאמנות גבוהה מיקס מאסטר </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> שלב ב &#39;, 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (קוואנט-IT) מגיב dsDNA </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> שלב א &#39;, 7.5.2 </td></tr><tr><td> תחתית עגולה פוליסטירן Test Tube </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> שלב א &#39;, 4.1 </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז קוקטייל טבליות (מלא, ללא EDTA) </td><td> רוש </td><td> 11873580001 </td><td> שלב א &#39;, 1.6 ואילך </td></tr><tr><td> Proteinase K פתרון (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> שלב א &#39;, 4.4, 7.5.1 שלב ב &#39;, 4.1 </td></tr><tr><td> האנזים T4 DNA </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> שלב ב &#39;, 2.2, 3.9 ו - 5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA האנזים חוצץ (חוד) </td><td> חוד </td><td> B0202S </td><td> שלב ב &#39;, 3.3 ו - 3.9 </td></tr><tr><td> T4 DNA פולימראז </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>שלב ב &#39;, 1.2 </td></tr><tr><td> T4 DNA Polynucleotide קינאז </td><td> חוד </td><td> M0201 </td><td> שלב ב &#39;, 3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS ערכת V5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> העוצרים עבור Illumina הגנום Analyzer IIx מערכת </td></tr><tr><td> TruSeq PE אשכול ערכת v2-cBot-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> להיות לשימוש עם מערכת Illumina cBot הדור אשכול </td></tr><tr><td> SYBR ירוק אני </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> שלב ב &#39;, 6.3 ו - 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock מיני נייד אלקטרופורזה מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> שלב ב &#39;, 6.3 ו - 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td colspan="2"> רצף </td><td> תגובות </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinylated חצי linkers (200ng/μl) </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;GG CCG CGA / iBiodT / ATC tta TCC AAC 3&quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים פנימי ביוטין DT (9) </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5 &#39;GTT GGA ט.א.א. גת ATC GC 3 &quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinylated חצי linkers B (200ng/μl) </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3&quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים פנימי ביוטין DT (9) </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG תאת ATC GC 3 &quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים </td></tr><tr><td rowspan="2"> ללא biotinylated חצי linkers (200ng/μl) </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;GGC CGC גת ATC GGA TCC AAC 3&quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC גת ATC GC 3 &quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 מתאם (200ng/μl) </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;המרכז לאמנות עכשווית TCT CAT CCC TGC GTG TCC CATCTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3 &quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5&#39;CTG AGA החטיבה GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG החטיבה GGA TGA גת GG 3 &quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 מתאם ב &#39;(200ng/μl) </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;CTG AGA CAC GCA ACA GGG גת AGG CAA GGC ACA החטיבה GGG ATA GG 3&quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5 &quot;CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3&quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN מתאמי </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים ראה שלב ב &#39;, 5.4 </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5 &quot;phos - גת CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3&quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים פוספורילציה סוף &#39;5 ראה שלב ב&#39;, 5.4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (קדימה) פריימר (10 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5 &quot;AAT גת ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3&quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (הפוכה) פריימר (10 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5 &quot;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA גת CGG TCC ATC TCA TCC CTG מס רווחי הון GTC 3&quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> QPCR פריימר 1.1 (10 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5 &quot;AAT גת ACG GCG ACC ACC GAG AT 3&quot; </td><td> 10nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> QPCR פריימר 2.1 (10 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5 &quot;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3&quot; </td><td> 10nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 רצף צבע יסוד (100 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3 &quot; </td><td> 100nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 רצף צבע יסוד (100 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AG 3 &quot; </td><td> 100nmole בקנה מידהHPLC מטוהרים </td></tr></tbody></table> לוח של oligos ומתאמים. Oligos סדר משולב של ה-DNA טכנולוגיות (IDT) ולהכין linkers ומתאמים באותו אופן כפי שתואר קודם לכן 10. חצאי linkers ומתאמים עשוי להיות מוכן מראש ולאחסן למשך מספר חודשים ב -20 ° C.

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

הגנום מאורגנים תלת ממדי מבנים, אימוץ מסדר גבוה תצורות בתוך מיקרון בגודל מקומות גרעיני 7, 2, 12. ארכיטקטורות אלה אינן אקראיות, הכרוכה אינטראקציות בין היזמים הגן ואלמנטים רגולטוריים 13. הכריכה של גורמי תעתוק ל רצפים רגולטוריים מסוימים מביא רשת של ויסות שעתוק ותיאום 1, 14. ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) פותחה כדי לזהות אלו מסדר גבוה מבנים הכרומטין 5,6. התאים הינם קבועים לוקוסים אינטראקציה נתפס על ידי קוולנטיים חלבון דנ&quot;א חוצה קישורים. כדי למזער את הלא ספציפית רעש להפחית את המורכבות, כמו גם להגדיל את הספציפיות של ניתוח האינטראקציה הכרומטין, הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש כנגד גורמים חלבונים ספציפיים כדי להעשיר את שברי הכרומטין של עניין לפני קשירת הקרבה. קשירת לערב חצאי linkers לאחר מכן יוצר קשרים קוולנטיים בין זוגות של קטעי ה-DNA קשורים זה לזה בתוך מתחמי הכרומטין בודדים. ההגבלה משני צדי MmeI האנזים אתרים את חצאי linkers לאפשר מיצוי של לזווג תגיות מקשר-Tag בונה הקצה (חיות מחמד) על העיכול MmeI. כמו חצאי linkers הם biotinylated, מבנים אלה חיות מחמד הם מטוהרים באמצעות streptavidin-מגנטיים חרוזים. חיות המחמד מטוהרים הם ligated עם הדור הבא של מתאמי ריצוף ו קטלוג של שברי אינטראקציה מופק באמצעות הדור הבא sequencers כגון Analyzer הגנום Illumina. מיפוי וניתוח ביואינפורמטיקה מתבצע מכן לזהות שבב מועשר אתרים מחייב שבב מועשר אינטראקציות הכרומטין 8. הפקנו סרטון להפגין היבטים קריטיים של פרוטוקול Chia-PET, במיוחד הכנת צ&#39;יפ, איכות שבב משחק תפקיד מרכזי בתוצאה של הספרייה Chia-PET. כמו הפרוטוקולים הםארוך מאוד, רק השלבים הקריטיים הם רואים בסרט.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא שיטה<em&gt; דה נובו</em&gt; זיהוי של אינטראקציות הכרומטין, להבנה טובה יותר של שליטה תעתיק.

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

יחיד קרא מותאמים mRNA-Seq סוף Illumina ספריות מ -10 ננוגרם RNA סך הכל

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...