Name: chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Gli autori sono supportati da A * STAR di Singapore. Inoltre, MJF è supportata da una borsa di studio STAR A * National Science, uno Oreal For Women in Science Fellowship nazionale e Lee Kuan Yew Post-Doctoral Fellowship. YR è supportato da sovvenzioni NIH Codifica HG004456 (R01-01 e R01 HG003521-01). Gli autori riconoscono anche la squadra videografia di 8 Pixel Productions, Singapore, in particolare il signor Kelvin Issey, Mr. Chang Kai Xiang e il signor Sherwin Gan per girare le scene, la signora Siti Rahim per il video editing e la signora Michelle Teo per la voice-over.

<ol>
	<li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB1+packages+densely+looped,+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes.">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li><li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+replication+and+transcription.">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li><li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states.">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li><li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei.">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li><li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing.">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22 (2010).</li><li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation.">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li><li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis.">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12 (2007).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li><li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+at+a+distance:+DNA-looping+and+initiation+of+transcription.">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li><li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Chia-PET è un metodo sviluppato per identificare le interazioni a lungo raggio di regolazione della trascrizione. Uno dei fattori critici che determinano la qualità di un Chia-PET libreria è la qualità del materiale ChIP. Il protocollo mostrato nel video incorpora l&#39;uso di EGS e formaldeide per reticolare le cellule. L&#39;uso di formaldeide combinato con un secondo reagente di reticolazione che porta un braccio più lungo distanziatore può aiutare nel legame di proteine ​​che non poteva essere vincolati dalla sola formaldeide 3,11,15. Abbiamo costruito librerie con questo metodo, che hanno dimostrato robuste siti di legame e interazioni a lungo raggio 9. Tuttavia, la reticolazione e condizioni chip dovrebbe essere ottimizzato per ogni fattore di interesse, ed è importante non troppo reticolazione come troppo reticolazione comporta difficoltà di frammentazione per sonicazione, e può eventualmente provocare interazioni cromatina spuri . Le interazioni della cromatinaidentificato da Chia-PET dovrebbe essere convalidato con un metodo diverso, come fluorescenza ibridazione in situ 4. Si consiglia un minimo di 100 ng di materiale cromatina. Mentre abbiamo costruito librerie di buona qualità da 50 ng di materiale cromatina, abbiamo osservato che grandi quantità di materiale di partenza ha permesso la costruzione di Chia-PET librerie con meno di 16 cicli di PCR, amplificati in modo da minimizzare e la ridondanza di ogni libreria. Questa ridondanza inferiore correlato con alti tag unici mappati e anche una percentuale elevata di dati utilizzabili, consentendo così una più completa mappa interazione cromatina con meno corsie di sequenziamento. Il volume finale ricco di perle in ogni tubo dovrebbe essere di 50 ul e 100 microlitri per biglie magnetiche e Sepharose rispettivamente. Se il volume ricco di cordone è inferiore a quella indicata, portare a volume minimo imballato con biglie magnetiche o Sepharose simile pre-autorizzato in bianco per ridurre al minimo la perdita di DNA-cuscinetto tallones nei passaggi successivi. Sawed-off consigli o suggerimenti di grandi dimensioni-core dovrebbe essere usato per pipettaggio perline Sepharose. Le modifiche seguenti sono stati inseriti a seguito della precedentemente pubblicato con il Chia-PET protocollo 5. In primo luogo, magnetici perle G sono stati utilizzati per ridurre al minimo la perdita del campione durante i lavaggi. Inoltre, abbiamo identificato non-specifici gruppi con dimensioni approssimative di 100 bp e 138 bp per essere ampliconi di auto-legato mezze linkers o / e adattatori. Pertanto, si riduce la concentrazione di biotinilati mezze linkers e 454 GS20 adattatori per ridurre al minimo non-specifiche bande durante l&#39;amplificazione PCR. Il volume vicinanza ligazione è stato ridotto da 50 ml a 10 ml per minimizzare la perdita di campione durante successive fasi di purificazione e di risparmiare sui costi dei reagenti. Abbiamo anche aumentato il tempo di incubazione di immobilizzare Chia-PET DNA a microsfere per garantire la cattura massima di Chia-PET DNA sulle perline streptavidina. Durante la fase di legatura di prossimità, legature chimerici that non rappresentano vero in vivo interazioni cromatina sono inevitabilmente generate in modo non specifico e casuale. Quindi, per valutare la qualità dei dati da qualsiasi Chia-PET esperimento, il tasso di chimerismo viene stimata dalla uso di due differenti mezze linkers nucleotidica specifica con codici a barre e TAAG ATGT 5. Dopo alta sequenziamento, il Chia-PET sequenze sono dapprima analizzati per la composizione barcode linker e sequenze derivate da prodotti di ligazione specifici e non specifici prodotti di ligazione si possono distinguere 8. La percentuale di chimere conosciute (ad esempio eterodimeri linkers AB) presenti nella nostra società in-house MCF-7 RNA polimerasi II Chia-PET librerie è inferiore al 15%. Chia-PET sequenze sono poi classificati in due categorie, vale a dire auto-legatura tra PET e PET-legatura. Self-legatura PET sono ottenuti da self-circolarizzazione legatura dei frammenti di cromatina, mentre inter-legatura PET sono derivati ​​da inter-ligazione tra due frammenti di DNA differenti. Quest&#39;ultimo è quindi suddiviso in tre differenti categorie a seconda della distanza genomica di ciascuna etichetta sul cromosoma stesso (intracromosomica inter-ligazione PET) o che entrambi i tag vengono mappati a due cromosomi diversi (interchromosomal inter-ligazione PET). Abbiamo sviluppato una Chia-PET pacchetto software strumento per risolvere le diverse categorie 8. Questo si basa sui frammenti di DNA che sono nella libreria. In generale, i frammenti più piccoli ChIP darà una maggiore risoluzione e la tagliata di questi RNA polimerasi II Chia-PET librerie è di circa 4 kb. Inoltre, le interazioni cromatina reali possono essere distinte dal rumore casuale contando il numero di inter-ligazione PET in un cluster interazione, in altre parole, un cluster di conteggio PET alto è detto avere una probabilità maggiore di essere una interazione cromatina reale 8 . Per filtrare i falsi positivi unopassare da ancore altamente arricchito, che può formare inter-legatura PET per caso a caso, un quadro di analisi statistica è stata formulata per spiegare la formazione casuale di qualsiasi inter-legatura animali da compagnia tra due ancore 8. In conclusione, il Chia-PET tecnica permette di mappare le reti di interazione cromatina su scala globale. L&#39;implementazione di ChIP in Chia-PET consente la riduzione della complessità della libreria e rumore di fondo. Inoltre, aggiunge ChIP specificità per le interazioni della cromatina, consentendo l&#39;esame delle interazioni della cromatina specifici associati a particolari fattori di trascrizione 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> 4-20% di pendenza TBE gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> Fase B, 6.3 </td></tr><tr><td> 5 x T4 DNA ligasi Buffer con PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> Fase B, 2.2 </td></tr><tr><td> 6% TBE gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> Fase B, 6.8 </td></tr><tr><td> Agilent DNA 100 Assay </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> Fase B, 7.1 </td></tr><tr><td> Agilent ad alta sensibilità del test del DNA </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> Centrifugare Filtri tubi (Spin-X) </td><td> Corning &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> Fase B, 3.7 e 6.9 </td></tr><tr><td> Reader Transilluminatore scuro </td><td> Clare Chemical Research </td><td> DR46B </td><td> Fase B, 6.8 </td></tr><tr><td> Digital Sonifier cella Disrupter </td><td> Branson </td><td> 450D-0101063591 </td><td> Fase A, 4,3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 magnete (Concentrator particelle magnetiche) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Fase A, Fase B 7.5.1, per tutte le biglie magnetiche lavaggio passi </td></tr><tr><td> DynaMag-15 Magnet (Concentrator particelle magnetiche) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> Fase A, 5 e 6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (Concentrator particelle magnetiche) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> Fase B, 6.5 </td></tr><tr><td> Escherichia coli DNA polimerasi I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> Fase B, 5,6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </td&gt; <td> Fase A, Fase B 7.5.1, 4.3 e 6.5 </td></tr><tr><td> Illumina CBOT System Cluster Generation </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> Fase B, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina Genome Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> Fase B, 7,5 </td></tr><tr><td> Illumina PE primer </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Fase B, 5,4 (se necessario) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico Biotech </td><td> RM-2L </td><td> Fase B, le incubazioni con rotazione </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR System </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> Fase A, Fase B 7.5.3, 7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Fase B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 streptavidina Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> Fase B, 5.2 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Magnetic (Dynabeads) Proteine ​​G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> Fase A, 5.1.1 e 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract ad alta densità (2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> Fase A, 7.5.1 </td></tr><tr><td> MaXtract ad alta densità (50ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> Fase B, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNAsi ONE ribonucleasi </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> Fase B, 4.8 </td></tr><tr><td> RNA polimerasi II (8WG16) anticorpo monoclonale </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> Fase A, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Provette da centrifuga Oak Ridge (polipropilene) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> Fase A, 3,1 </td></tr><tr><td> Provette da centrifuga Oak Ridge (Teflon FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> Fase B, 4.3 </td></tr><tr><td> PHUsion ad alta fedeltà Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Fase B, 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (Quant-iT) reagente dsDNA </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> Fase A, 7.5.2 </td></tr><tr><td> Polistirolo Provetta a fondo sferico </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> Fase A, 4,1 </td></tr><tr><td> Cocktail di inibitori della proteasi compresse (completo, EDTA-free) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Fase A, 1.6 in poi </td></tr><tr><td> Proteinasi K Solution (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> Fase A, 4.4, 7.5.1 Fase B, 4.1 </td></tr><tr><td> DNA ligasi T4 </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Fase B, 2.2, 3.9 e 5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA ligasi Buffer (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Fase B, 3.3 e 3.9 </td></tr><tr><td> DNA polimerasi T4 </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>Fase B, 1.2 </td></tr><tr><td> DNA T4 polinucleotide chinasi </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> Fase B, 3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Kit v5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Reggenti per Illumina Genome Analyzer IIx sistema </td></tr><tr><td> TruSeq PE Cluster Kit v2-CBOT-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> per essere utilizzato con il sistema Illumina Generation Cluster CBOT </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Fase B, 6.3 e 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis sistema </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Fase B, 6.3 e 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td colspan="2"> Sequenza </td><td> Comments </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinilato mezze linkers A (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato interno Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinilato mezze linkers B (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato interno Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato </td></tr><tr><td rowspan="2"> Non biotinilati mezze linkers (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptor A (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;CAT TCT CCA CCC TGC GTG TCC CATCTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adattatore B (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;CTG AGA CAC GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATC CCC CCT TGT GTG CCT TGC CTA GTT TCC CCT GCG TGT CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN adattatori </td><td> Top </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato Vedi Fase B, 5.4 </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;phos - GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato fosforilata 5 &#39;Vedere B Step, 5,4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (in avanti) primer (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC ACC GAG ATC TAC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (reverse) primer (10 micron) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 1.1 (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG A 3&#39; </td><td> 10nmole scala PCR Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 2.1 (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole scala PCR Grade </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 sequenziamento primer (100 um) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole scala HPLC purificato </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 sequenziamento primer (100 um) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT TGC CTA GTT TCC CCT GCG TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> Scala 100nmoleHPLC purificato </td></tr></tbody></table> Oligo ordine Tabella di oligo e adattatori. Da Integrated DNA Technologies (IDT) e preparare linkers e adattatori nello stesso modo descritto in precedenza 10. Mezze linker e adattatori possono essere preparate in anticipo e conservati per diversi mesi a -20 ° C.

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

Genomi sono organizzati in strutture tridimensionali, adottando ordine superiore conformazioni all&#39;interno degli spazi nucleari dimensioni micron 7, 2, 12. Architetture di questo tipo non sono casuali e comportano interazioni tra geni promotori e gli elementi normativi 13. Il legame di fattori di trascrizione specifici per sequenze regolatrici determina una rete di regolazione della trascrizione e coordinamento 1, 14. Interaction Analysis cromatina per tag Sequencing paired-End (Chia-PET) è stato sviluppato per identificare queste strutture sovra-ordinate cromatina 5,6. Cellule vengono fissate e loci interagenti sono catturati dal covalenti DNA-proteina legami incrociati. Per minimizzare il rumore non specifico e ridurre la complessità, così come per aumentare la specificità del analisi dell&#39;interazione cromatina, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) viene usato contro fattori proteici specifici per arricchire frammenti cromatina di interesse prima legatura prossimità. Legatura coinvolgendo mezze linkers successivamente forma legami covalenti tra coppie di frammenti di DNA legati insieme all&#39;interno di complessi cromatina individuali. I accompagnamento MmeI siti di restrizione degli enzimi nella mezza linkers permettono l&#39;estrazione di coppie di terminali tag-linker-tag costrutti (PET) su MmeI digestione. Poiché le mezze linkers sono biotinilati, questi costrutti PET sono purificati utilizzando streptavidina-perle magnetiche. Le PET purificati vengono legati con la prossima generazione di adattatori di sequenziamento e un catalogo di frammenti interagenti viene generato tramite sequencer di nuova generazione come il Illumina Genome Analyzer. Mappatura e analisi bioinformatica viene quindi eseguita per identificare ChIP arricchito vincolante siti e ChIP arricchiti interazioni cromatina 8. Abbiamo prodotto un video per dimostrare aspetti critici del Chia-PET protocollo, in particolare la preparazione del chip come la qualità di ChIP gioca un ruolo importante nel risultato di una Chia-PET libreria. Poiché i protocolli sonomolto lungo, solo i punti critici sono mostrati nel video.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Interaction Analysis cromatina per tag Sequencing paired-End (Chia-PET) è un metodo per<em&gt; De novo</emRilevazione&gt; delle interazioni della cromatina, per una migliore comprensione del controllo trascrizionale.

Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Ricerca

Biologia

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Leggi singolo e accoppiamento finale mRNA-Seq Biblioteche Illumina da 10 nanogrammi di RNA totale

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con Drosophila Tessuto

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Generazione e Purificazione di umani INO80 rimodellamento della cromatina Complessi e Sottocomplessi

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

L&#39;isolamento di regioni genomiche specifici e l&#39;identificazione di molecole da Associated enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...